组织透明化，看看科学家⼜有哪些新⽅法？⾃那时起，研究⼈员不断开发出能够更好地保留组织结构和蛋⽩质结构的化合物，让组织透明化技术不断得到改善。最近，《The Scientist》杂志介绍了组织透明化⽅⾯的⼀些新技术，有助于实现⾼分辨率的⼤脑成像。哺乳动物的⼤脑由数⼗亿个神经元组成，这些神经元通过不同的回路连接在⼀起，⽽每个回路都参与了特定的⽣理功能。为了更好地了解这些不同的神经元和回路如何与⼼理活动和疾病相关联，研究⼈员正在重建神经⽹络的三维图。然⽽，哺乳动物⼤脑的3D成像是⼀项很有挑战性的⼯作。光在穿过各层组织时会被⽔、脂质和蛋⽩质等各种分⼦散射，这会⼤⼤降低图像分辨率。于是，研究⼈员从组织中去除⽔和脂质来减少散射，同时引⼊化学物质让⽣物组织变得透明。2013年，哈佛⼤学的Karl Deisseroth及其团队开发出的CLARITY⽔凝胶技术轰动了全世界。这项技术使研究⼈员能够⽤荧光标记物标记⼩⿏神经组织中的神经元，然后在不切⽚的情况下对整个⼩⿏⼤脑进⾏成像，同时保留荧光信号。⾃那时起，研究⼈员不断开发出能够更好地保留组织结构和蛋⽩质结构的化合物，让组织透明化技术不断得到改善。最近，《The Scientist》杂志介绍了组织透明化⽅⾯的⼀些新技术，有助于实现⾼分辨率的⼤脑成像。与脂质兼容的透明化⽅法研究者：华中科技⼤学，朱丹许多组织透明化⽅法都会利⽤有机溶剂或去垢剂来降解细胞膜的脂质，同时采⽤脂质染料来染⾊神经元和细胞器。朱丹及其团队于是开发出⼀种称为RTF的⽅法，与脂质染料兼容（Sci Rep,8:1964, 2018）。RTF是⼀种包含⽔、甲酰胺和三⼄醇胺的溶液。早前，另⼀个实验室⽆意中发现甲酰胺能够让组织变得透明。⼀些研究表明，甲酰胺很有可能让蛋⽩质部分变性，降低其折射率并使其更接近⽔和脂质，从⽽创建了折射率更均匀的环境。朱丹领导的研究团队发现，利⽤RTF让⼩⿏⼤脑变得透明之后，内源蛋⽩的荧光信号没有被淬灭，另⼀种⼴泛⽤于轴突染⾊的脂质染料Dil的信号也没有被淬灭。其他技术⼤约需要⼀周的时间让组织变得透明，⽽RTF只需要⼀天的时间。这个过程也是可逆的，将组织浸泡在盐⽔中，透明的组织可以恢复到原始状态。不过，RTF不适⽤于厚度超过1毫⽶的成年⼩⿏脑组织。透明化的组织还存在2%到5%的收缩，这会降低组织结构成像和神经⽹络的准确性。此外，抗体渗透到透明化组织的速度会减慢，今后他们打算解决这个抗体减速问题，从⽽进⼀步减少组织处理时间。⼩贴⼠：为了优化组织的透明度，朱丹教授建议调整其实验⽅案中的处理时间。尽管RTF并未在市场上销售，但这些试剂价格便宜，可以⾃⾏配制。她认为，透明化过程⽐其他⼤多数组织处理技术更简单。让硬组织和软组织都变得透明研究者：德州农⼯⼤学，Hu Zhao现有的透明化⽅案并未同时针对⼤脑和脊髓等软组织以及钙化的硬组织（⽐如⾻骼）进⾏优化。这使得⼈们难以观察中枢神经系统和周围神经系统之间的完整连接，因为脊髓中的周围神经连接到椎⾻，⽽椎⾻不透明⽆法成像。Zhao及其团队开发出⼀种名为PEGASOS的⽅法，可让软组织和硬组织同时变得透明（CellRes, 28:803–18, 2018）。它的不同之处在于使⽤聚⼄⼆醇（PEG）来增强荧光信号，并增加了两个步骤：硬组织的脱钙和有⾊组织（如肝脏）的脱⾊。处理⽅法有两种：将组织浸泡在溶液中；或⽤灌注泵将溶液泵到全⾝。他们利⽤PEGASOS⽅法来追踪⼤⿏脊柱两个不同节段之间的轴突，并观察脊髓内的神经元，⽽⽆需通过⼿术将它们与椎⾻分开。他们还发现，神经集中在某些⾻骼区域内。不过，PEGASOS的处理会导致组织收缩30%到40%，这可能会使组织结构变形。对于浸泡的组织，透明化过程⼤约需要7-12天。整个⽣物体的透明化显然需要更长的时间，因为透明化溶液必须循环处理10天，这样年幼⼤⿏的透明化时间⼤约为三周，⽽成年⼤⿏的循环时间还要加倍，因为它们的组织更多。未来，研究⼈员打算解决组织收缩的问题，并减少与之相关的⾃发荧光。
⼩贴⼠：组织透明化只是万⾥长征的第⼀步，⽽随后的成像和数据处理则更具挑战性。Zhao博⼠建议新⽤户不要⼀开始就处理整个器官，⽽是从薄薄的组织切⽚开始，以便熟悉整个流程。这项技术使⽤的试剂都是现成的，他估计整个⼩⿏⼤脑的透明化成本⼤约为30美元。不但透明，⽽且放⼤
研究者：东京⼤学，Hiroki Ueda
现有的⼤多数⼤脑透明化技术都⽆法使组织变得完全透明，因此很难以单细胞分辨率构建⼤脑图像。东京⼤学的Ueda及其同事在筛选了将近1,700种化学物质后，开发出⼀种名为CUBIC-X的⽅法，不仅可让脑组织变得透明，⽽且还能膨胀数倍（Nat Neurosci, 21:625–37, 2018）。他们将组织浸没在亲⽔性试剂中，使⼤脑的体积膨胀约⼗倍。利⽤这种操作，Ueda及其同事能够对厚度为1厘⽶的⼩⿏⼤脑进⾏成像，⽽不会丢失任何细胞。此外，由于膨胀的组织中⼤约99％是⽔，因此整个⼤脑各层的折射率⼏乎保持不变。这会使组织变得透明，并使得单细胞成像的光透射率接近100％。
不过，这种让组织膨胀的化学物质往往会淬灭神经元和RNA标记的荧光信号。利⽤CUBIC-X让整个⼩⿏⼤脑变得透明，⼤约需要16天。下⼀步，Ueda希望将这种技术应⽤在其他器官，包括⼼和肺。
⼩贴⼠：研究⼈员创建了开放获取的⼩⿏⼤脑地图集CUBIC-Atlas。⽤户可将其数据与这个地图集进⾏⽐较，评估⼤脑透明化处理的重复性。CUBIC-X试剂现已上市（Tokyo ChemicalIndustry），25 mL的售价为50美元，⾜够处理⼀只⼩⿏的⼤脑。保护功能出⾊的SHIELD⽅法
研究者：⿇省理⼯学院，Kwanghun Chung（CLARITY技术的开发者）
在组织透明化的过程中，⼈们往往利⽤酶和化学物质来消化组织，去除脂质，有时还会让样品脱⽔。这个过程不可避免地会降解蛋⽩质和RNA，破坏关键的分⼦信息，还会淬灭荧光信号。Chung及其同事采⽤⼀种称为聚环氧化物的材料来解决这个问题。
研究⼈员筛选了六种环氧化物，并通过计算机模拟来确定哪种能最好地保留绿⾊荧光蛋⽩
（GFP）的荧光。然后，他们将选定的环氧化物注⼊转基因⼩⿏的脑组织中，这些⼩⿏的神经元表达GFP。在那⾥，环氧化物与GFP发⽣反应，形成柔性化学键。这些键能够避免GFP在透明化过程中变性，并允许GFP在处理后重新回到其天然构象。
Chung及其同事表明，这种名为SHIELD的⽅法可保持荧光蛋⽩的信号，保护内源性蛋⽩质和RNA的结构，并降低⾃发荧光（Nat Biotechnol, 37:73–83, 2019）。它可以保留蛋⽩质与抗体结合的能⼒，以及RNA转录本与探针结合的能⼒。
整个⼩⿏⼤脑的SHIELD处理⼤约需要四天。随后的组织透明化还需要四到六天，故整个过程总共需要两周。下⼀步，研究⼈员计划将SHIELD⽤于更⼤的器官甚⾄肿瘤。他们还开发出⼀种改进的系统，可促进抗体对组织的渗透，从⽽加快标记速度。
⼩贴⼠：组织经过SHIELD处理后会变得较硬，延缓抗体渗透的速度，因此整个⼩⿏⼤脑的抗体标记时间须延长两天。SHIELD已上市，可联系Life Canvas Technologies购买。⼀个500毫升的试剂盒售价为1,000美元，能够处理⼤约16只⼩⿏的⼤脑。