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IPP使用教程

2024-06-10 来源：步旅网

Image pro-Plus6.0 使用教程

一、入门.............................................................................................................................................. 2

二、AOI技巧（1） ............................................................................................................................. 9

三、AOI技巧（2） ............................................................................................................................14

补充：不规则区域计数 ...............................................................................................................20

四、编制宏 .........................................................................................................................................23

五、计数.............................................................................................................................................27

六、校正标尺......................................................................................................................................33

七、几何测量......................................................................................................................................41

八、图象分析策略...............................................................................................................................43

九、其他有趣功能...............................................................................................................................45

十、光密度 .........................................................................................................................................51

十一、免疫组化光密度测量 ................................................................................................................56

十二、macro......................................................................................................................................58

十三、荧光强度测量 ...........................................................................................................................64

柏奥易杰-整理

一、入门

既然是处理图片，当然是先要打开一张要处理的图片嘛。在你开始学习使用 IPP 之前，我假定你是会初步使用 office 及 photoshop 等常用程序的。如果一点电脑常识也没有，那还是先学点简单的程序再回来玩

IPP。

因此我跳过了打开图片，copy 、paste、象素的概念之类最基础的知识与操作。这些用不着我来讲。

这张照片中的黄色部分是免疫组化染色的阳性表达成分。处理目标是通过测量图片中黄色部分的\"黄\"度来反映相应蛋白表达的的\"量\"。对该图片进行观察，可以看到图片中主要有三种主要颜色，一是染成蓝色的细胞核，二是呈现出黄色的胞浆，三是细胞间的空隙区域，呈现出浅蓝色，是为背景。所以首先要把图片中呈现黄色的区域给挑选出来，然后才是测量这些挑出来的区域的各种测量参数，如面积、平均半径、周长、光密度等等。这部分需要挑出来进行测量的区域是我们最感兴趣的地方，叫作 AOI(area of interest)。AOI 是 IPP 中最有用最重要的概念。如何能够准确地选取 AOI 就是使用 IPP 的关键操作。一旦准确地选取了 AOI，下面的测量分析就好办了。在其他的测量软件中，选择这种不规则的区域一般只能用手拖着鼠标来画，而在 IPP 程序里，可以通过设置颜色范围让电脑来帮助你选择这些不规则区域，这样的选择就准确多了。可以说，使用 IPP 的要点就是灵活地使用各种 AOI 工具准确地把那些需要测量的区域给挑选出来。对不同的图片，需灵活地使用各种适当的 AOI 工具，先用最简单的，当然，简单的工具只能作简单的事，就这张图片来说，用简单工具选黄色有点困难，我们先用它来选择蓝色的细胞核吧。

点击 measure---count/size,弹出分类测量窗口。

在窗口中选中 manual,再点击 select color,弹出颜色选择窗口 segmentation,这个工具是 IPP 最有特色的颜色选取工具之一。用好这个工具是使用 IPP 的要点。

对于目标颜色鲜明的图片，用吸管工具是最简单的。点一下吸管图标，在目标区域点一下，就可以选中该点的颜色，当然一下是不可能完全选中所需要指定的全部区域，可以在未选中的地方接着再点，这样多次选取，直到把想选中的区域全部选中为止。

在这张示例图中，选中的蓝色细胞核部分被标上了红色。用红框圈起来的四个工具按纽分别是:吸管、撒消上一步操作、橡皮擦、全部清除。下在的小方框里则是吸管位置的选取颜色。

图片中被标上红色的区域被定义为一个 class,其中每一个独立的小区块被定义为这个 class 中的一个 object。以此图为例，图中深蓝色的部分是细胞核，因此所有的细胞核都被选中成一个 class，其中每一个细胞核就是一个 object。

选取完 AOI 后，点击 close 回到 count/size 窗口，下一步就可以对选中的 object 进行测量操作了。

量选择窗口左侧列出了各种可用的测量选项，最常用的测量有:

点击 count/size 窗口中的 measure 菜单，点 select measure，这是选择要进行何种测量操作，在弹出的测

area 面积 density(mean)平均光密度 diameter 直径

IOD(integrated optical density)累积光密度在相应的项目上点一下，该测量项目就被选到中间的窗口中了，同时关于该测量的详细说明会显示在最右边。如果想取消某个已选中的测量项目，则在左边窗口中该项目上再点击一下就可以了。

选好了待测量的区域，也指定了测量项目，就可以进行测量统计了，点击一下测量选择窗口的 OK 纽，关闭这个窗口，就回到了 count/size 窗口，再点击一下 count 按纽，就可以看到程序在进行测量，稍等几秒钟即可读取测量数据。

分别点击 count/size 窗口中 view 菜单中的 measurement data 和 statistics，就分别弹出这两个数据窗口。前者是这个 calss 中每一个 object 的测量数据，后者是这些测量数据的统计参数，如总数、平均值、累加、标准差等。本例中得到的就是每个细胞核的面积、平均光密度值、直径、累积光密度值。统计数据则可得到这张图片中所有细胞核的平均面积、平均光密度值，平均直径、累积光密度值，当然还有细胞核的数目，就是所有 object 的数目。

测量数据转入 EXCEL 处理起来最方便。只要在数据菜单中点 file - DDE to EXCEL。数据就传到 EXCEL 的 sheet1

里去了。

在这个示例图片的统计数据中

samples 为图中所有细胞核的个数。

第一列为 area,其中的 Mean 值为各个核的平均面积，后面就是平均灰度、平均直径，这些是有意义的测量统计数值。但 IOD 却是 SUM 值更有意义。

订正：

在上述操作中漏掉了一个重要步骤，就是要转换图象 intensity 格式。

光密度，染色越深，光密度值越大。

在默认的 intensity 格式中，是图片灰度，越黑数值越小，越白数值越大。而实际上我们测量的染色强度是

如果不进行光密度单位的转换，测量的数值将完全是错误的。转换光密度单位的方法如下:

点击:measure--carliberation--intensity，调出 intensity 校正窗口。

反向的曲线。

然后还要点一下最上面的 system 按纽。最后点 close 关闭窗口。

然后在窗口中点 new 按纽，再点一下下面的 std optical density 选项，这时可以看到窗口中的直线变成了

这样就把程序系统的灰度单位转换成了光密度单位。

关于光密度较正的详细内容请参见第十帖及第十一帖。校正光密度单位的操作要在打开第一张图片后立即进

行。将光密度单位设定为 system 之后就不必再对后面的每一张照片都进行光密度校正了。整个分析测量过程就是这样。当然，光知道这一点是远远不够的。在以上所述各个步骤中有许多技巧和方法能使测量数据更加准确合理。本人将另发帖子分别详细叙述。欢迎大家提问。此主题到此结束。

IOD=density(mean) * Area

density 反映了阳性蛋白的浓度或强度，但 IOD 能反映选定区域的蛋白表达总量。一个典型的示例是:阳性样品切片中有大片的黄色区域，而阴性切片上只有少量的黄色区域，但是两者的黄色都很深。这样测量的阴性切片与阳性切片的黄色区域的 density mean 就没有差异，差异在于其黄色区域的面

积上。

如果是一个不典型的图片呢:一个黄色深但面积较小，另一个黄色浅却面积较大，那一个蛋白表达更强?这时用 IOD 就更准确了。

二、AOI技巧（1）

在 IPP 中，最有特色，最有用处的工具有两个。一个就是我们已经看过的 segmentation 工具，另一个是 irregular 工具。

我们先看 irregular 工具。这是一个用来描绘不规则孤立对象边界的工具。图中一个个棕黄色形状是免疫组化染色的贴壁培养细胞，为了计算每个细胞的面积及蛋白表达，首先就是要选取每个细胞的边界线。这就可以用到 irregular 工具了。在工具栏上点一下那个不规则园形的按纽，就调出了 irregular 工具条。

这个工具的标题叫 Magic wand，就是 photoshop 中的魔棒呀。将鼠标移至图中一个细胞的中间，光标就变成魔棒了，在一个位置左键点一下，就选中了这个位置及其周围灰度相似的区域。这里\"相似\"的定量范围由 Range 的值来决定。较大的值为较大的灰度范围，点一下能选中一大片区域。较小的 range 值则为较小的灰度范围。在一个区域上多点几下，就能选中这个区域的整个边界了。最后点一下右键，就确定了一个不规则形状的选定区域。

点一下左边的问号，就能看到相应的使用说明。smooth 值是用来平滑区域边界的。一般不需要平滑，因此默认值为零。

选中一个区域后如果还要在同一张图片上再选另一个区域，不能直接点选，要先点击一下工具栏上的 Multiple AOI 按纽，再点击 add，接下去就可以到另一个选择区域点选。选好一个新的区域后再回去点 Multiple AOI--add 确认，再继续下一个，直到选取完所有的 AOI。最后在图片上任一处点一下右键结束选择操作。结束后如果又想再增加选择区域，只要再点一下 newAOI 按纽，就可以调出工具条继续增加选择区域。

这个 irregular 工具还有另一个操作方式，在问号旁边有个 trace 按纽，点一下它，工具条就变成另一个样子了。这种操作方式是沿着孤立图像的边缘寻迹，从而画出一个沿着孤立形状边缘围成的一个 AOI。第一种是手画法。确认工具条右边的 Auto 选项没有打勾，将光标移至目标图形处按住左键拖出一个闭合图形，点右键结束。

第二种方法是自动寻迹。

用鼠标画当然是不会准确的。实在没别的招了才会出此下策。

把那个 Auto 给选上，speed 值给减到 1(慢速看得清楚)，在目标图形的边缘处左键点一下鼠标，然后沿着边缘稍移动一下鼠标后再点击一下左键，这是给程序指明一个寻迹的方向，马上就能看到光标自动沿着边界走起来了，一直会走到起点处才会停止。这样就自动围成了一个闭合区域，点一下右键就确认了这个 AOI。重复选取多个 AOI 的方法与楼上一样。

如果目标图形边界清晰，那么这个工具是非常管用的。可惜的是在许多情况下边界是模糊不清的，光标走到此处时会乱走一气。这时就要及时先点一下鼠标使光标暂停下来，然后在期望的方向延长再点一下左键，给程序指明一下前进的方向，如此多次，直到光标回到起点为止。最后点一下右键围成一个闭合的 AOI。围好的 AOI 边界是绿色框。

自动寻迹挺好玩吧?不过别忘了我们的目的。选好了一个个的 AOI 后当然是要测量每个区域的几何尺寸及光

密度啦。下面该怎么作呢?

点开 count/size 窗口，点菜单 EDIT---convert AOI to Objects.这样就把刚才选中的一个个 AOI 变成了要测量的 object 了，那些小区域的颜色也由 AOI 绿色外框线变成了 object 的标记了。

object 的标记类型是可以自己设定的。在 count/size 窗口右边有一个 option 按纽，点开它就能设定 object 标

记的外观了。在 option 窗口中，outline style 可以选 outline(轮廓线)或 filled(填充 class 颜色)。label style 可

以选择为 object 序号或测量值。再下面是 label 的文字颜色。右上角还有一个 class 的颜色选择按纽。估计大家自己试一下都会用的。

下一步是点 measure 菜单下的 select measurements。选上要测量的项目。注意，选完后要点击这个菜单中的 measure 按纽(而不是 count/size 窗口中的 count 按纽)。然后是 OK 按纽关闭 measure 窗口，点开 view 菜单下的 measurement date 和 statistics 数据窗口。几个 object 的测量数据就已经在里面了。

如果你还想继续增加 objcet，可以直接用 irregular 工具画 AOI，然后点 convert AOI to object。这期间把数据窗口留着不关闭，可以看到新增的 object 测量数据会立即被更新。

三、AOI技巧（2）

在上一主题中讨论的主要是 irregular 工具，它对于大个的孤立图形对象的选取是有用的。而面对组织切片中密密麻麻的细胞，就得用本主题讨论的 segmentation 工具了。

实际上，在第一部分入门中所用的就是 segmentation 工具，在那里我用颜色吸管选取了图片中蓝色的细胞核，但是如果仔细观察一下选取的效果就会发现，有一些挨在一起的两个以上的细胞核被识别成了一个，另有一些蓝色的杂质颗粒被错误地识别成了细胞核。

如果你试着用吸管工具选取一下图中黄色的免疫反应表达区域，就会发现因为黄色很浅，很不容易准确地选取。所以对于 segmentation 工具还需要有更多的应用技巧。火锅在我之前已经介绍了不少，我在这里班门弄斧是为了保持我这个系列主题的内容完整。同时也是系统地整理一下这个工具的使用方法。

让我们还是从打开图片并调出 count/size 窗口开始吧。

对这种色彩饱和度低，各种成分颜色区别很小的图片来说，用吸管是很难准确选择到正确的颜色区域的。在 count/size 窗口里选中 manual，并点 select color 调出 segmentation 窗口。窗口里有两个表单，一个是 color cube based，另一个是 histogram based。如果你测量的对象颜色单一，色彩对比大，则使用 color cube based

中的吸管就可以方便地选择到需测量的区域。而对于那些有颜色深浅及亮度不同的测量区域，我们要选取后者，并且使用 HSI 颜色格式来进行分色选择。当切换到 HSI 时，会弹出一个窗口提示你会 reset 颜色选

择，是否继续?当然是 OK 啦。这时的颜色选择全部重置为 0-255。

在 HSI 颜色格式中，H 为色调，就是我们眼睛所看到的红橙黄绿青蓝紫等。S 为色饱和度，I 为强度。在选择 AOI 时，首先保持 S、I 为最大范围，从 H 中选择黄色部分。使用这个颜色格式的好处是，选择的颜色能包括这种颜色的不同深浅及亮度。最适合于测量免疫组化图片。

点一下 H，直方图显示就是图片各象素 H 值的分布，在直方图的两边各有一根线，这就是选择线，先将右边的线用鼠标左键向里面拉，拉一点停一下看看效果，可以看到最开始时是选中了全部画面，然后是蓝色的区域慢慢显露出来，并且越显越多，选择线的位置也在下面的窗口中有显示，是 0-255 之间的数，共有两个窗口，左边是取值下限，右边是取值上限，先不断减小上限值使得非黄色区域不断地显露出来，再不断增加下限值让另一部分非黄色的区域也显露出来。

这张照片中黄色区域为 H:0-33。

色饱和度 S 与强度 I 都直接设为 0-255。这就是说，只要是黄色，就被认为是阳性表达的区域。

选好了颜色范围，点 close 关闭 segmentation 窗口，回到 count/size 窗口，点 measure 的 select measurement ，

选中 area, density(mean),IOD。坏事了，这个窗口的 measure 按纽是灰色的，不能用。回到 count/size 窗

口，按 count 纽，也一样不好用!!!或者点 count 后计算的区域根本就不是刚才选取的正确区域。

这是使用 HSI 选色时最常犯的错误:只是操作顺序不对。正确的操作顺序是:

先打开 select measurement，选择好各个测量项目，再回到 count/size 中点 select color 进行颜色选取，再回到 count/size 窗口中点 count 计数。这样操作结束后仔细观察一下计算的区域，正是刚才正确选取的区域了。

这样选取的区域还是有一点不准确。图片中被选中的区域有许多很小的选点，显然这是各种杂质，并不是成片的蛋白表达区域。对这些杂质小点有一个有效的方法来去除，就是测量过滤。(filter)

打开 select measurement 窗口，点一下中间被选中测量项目中的 area 项，使其加亮。这时下面的 start 与 end 选项就变黑可调了。对 area 来说，默认值一般是 0，意思是不管区域有多小，都被计入测量范围内。现在我们把它改为 50，也就是说，忽略了象素点小于 50 的杂质点，不予计算在内。

改完后点一下旁边的 Filter 按纽，再点 measure 按纽。或者回到 count/size 窗口内把 Apply Filter Ranges in Range 前面的选项给勾上，再点 count 按纽。这回就把小杂质点全给过滤掉了。

过滤是一种很有效的选取 AOI 的手段，除了定义面积范围进行过滤以外，还可以选取 BOX X/Y 测量项目，这是 object 外切长方形的长宽比，如果是园形的 object，这个值应该是 1，在作园形的细胞计数统计时，把这个值的范围设定在 0.5 到 2.0 之间，就可以滤掉长条形的杂质 Object,当然同时也可以设面积过滤范围。把那些通过颜色选择不能排除的 object 给进一步排除掉。类似的测量选项还有 Radius Ratio 等，通过这些测量值的过滤，可使得 AOI 选得更加准确。

显微镜图象千差万别，每一次进行分析都需根据具体的图像情况来选择 AOI 方法。前面所述的各种技巧需交替应用。

凡是玩电脑都必会有一个 reset 键。不管作错了什么事，按一下 reset 键就可以全部重新来。选 AOI 也是这样，如果选得不合心意，想全部重新来的话，按 count/size 窗口中的 delete 键，就可以把刚才作的一切都给全部推倒重来了。

另外还有一个是反向选择。在选文件夹与 word 的 edit 菜单里都有这项功能。segmentation 里也有这个哟。在前面的图象里，选好颜色后，点一下用红圈标注的那个按纽，就实现了反向选择。

关于 segmentation 窗口中其他一些按纽的用处，大家可以从帮助文件中查找。尽管帮助文件是英文的，看起来有点困难，但中文的帮助文件翻译得不准确，有时比英文的还难懂呢。

总结一下 segmentation 工具的用法，有两种，一种是在 color cube based 模式中用颜色吸管来选取目标颜色。另一种是在 Histogram Based 模式中利用 HSI 范围来选取目标颜色。二种方法各有其优点，其共同之处就是把图片中相同颜色的区域给定义成一个 class，以便对它们进行分析处理。

在 segmentation 窗口的下方还有一些有用的功能。

在 priview 框中，上面一个选项是对选择的区域标注ckass 颜色的，可以选择不标色，只标当前class 颜色(current class)或者所有 class 颜色。下面一个选项则是对选中区域与非选中区域分别标上不同颜色的选择，我一般选择 class color on transparent。

这样在选择颜色时能观察尚未被选中的部分。如果把一部分选成 black，其效果就等于把这一部分从图象中抠去，这个处理也是很有用的。标注上了 class 颜色的图象可以点 creat priview image 按纽来另存成一个新图片，

窗口最下方的 file 按纽是用来保存颜色选取参数的。这个颜色参数文件非常有用。在处理一组多个图片的时候，不能每个图片都选择一次颜色，这样各个图片的选择标准不一致，而且费时间。先处理一张典型的图片，把颜色选择参数保存成一个文件，在处理下一张图片时，只要把这个文件再调出来就行了。这个操作在使用宏操作时是必须的。

segmentation 工具与 irregular 工具在 count/size 中可以灵活应用。

2.单独使用 segmentation 工具，对颜色对比明显的区域可简单使用吸管选色，对颜色不明显的图片用 HSI 格式来选择同样色调的区域。

1.单独使用 irregular 工具画一个或几个孤立区域，只测量它们几个的各种参数。

3.同时使用 irregular 与 segmentation 工具，前者可以限制图片上的一个测量范围，后者则选择了这个范围内的特定颜色区域。具体作法请看下面几楼 super270 的跟帖。这可是高级的 IPP 技术呀。相比之下，实际上我讲的都是基本的，初级的使用方法。

4.在选色窗口中还有一个 class1 的下拉对话框，就是说，我们可以分别选择两种以上颜色，然后同时计算它们的各种参数。例如，我们可以先选择蓝色的细胞核并给它们标上紫色的标记色，再新建一个 class2，选择黄色的免疫组化染色区域，并给它们标上红色。有时候我们会不得不使用这个技术：有的照片照得偏蓝色。这样在使用 segmentation 选择黄色的区域时会发现，一部分黄色的 HSI 值在 0-30，而另一部分黄色区域的 HSI 值却在 230-255 之间。这时就不得不分别选择两个 class，分别计算其 IOD 及 area 之后再把它们相加起来。

这大概也算是高级一点的技术吧。

补充：不规则区域计数

1．使用不规则 AOI 工具划出感兴趣的区域。

2。然后在 Count/Size>Manual>select color 窗口，使用选色滴管选择感兴趣的颜色。在预览状态下，整幅图

像内的同类颜色都被显示为选中了，但是不要紧....

3. 返回 Count/Size 主菜单，点 Count 钮，只有 AOI 内的对象被计算了。

4. 这样我们就将不要的周边区域“细胞”的干扰去掉了，然后进行选色，再计数。遭了，但是不能计数啊，怎么办呢？？？是这样的，把不规则区域选定后，选择自动计数/测量按钮，然后选择编辑，然后选择将 AOI 转换为对象，然后计数，再 delete，然后才能重新选色，以后的步骤就同陈老师说的一样了。还有一种可能是你忘记关闭最后的 AOI。

把干扰区域填成白色或黑色是可以的。这就跟在镜下选择一个适当的视野一样。用重复选 AOI 的方法对于初学者来说很容易出错，但是当你使用 IPP 熟练了以后，这个方法将非常有效。软件就是这样，高级的技术使用起来很有效果，但学起来得费点事。再次强调在测量前一定要作光密度较正。否则测出的 IOD 值是无效的。

四、编制宏

我以前也不敢轻易使用宏，但是处理过大批量的数据之后才发现，宏是非用不可的工具，而且编制宏并不难。实际上宏不过是把一连串的操作集合到一个操作的有效工具。

当你只处理一张图片时，可真的用不上宏。但是当你作了两组实验动物，每组 5 只，每只动物切出来五张组织切片，每张切片选取了 5 个视野拍下了照片，这就一共有 2*5*5*5=250 张照片。如果你用 IPP 处理一张照片用时两分钟，就一共需要 500 分钟=8 小时。这还不包括你因为操作错误所耽误的时间。

在处理一组照片时还有一个重要的因素要考虑，当你选取 AOI 时，是根据眼睛的判断来作出选择的，在两张

照片之间仅用眼睛来判断很难保证这之间的判断在客观上完全一致。更何况 250 张照片呢?

所以，如果你需要处理大量的图片，花点时间学习编制自动操作的宏是值得的。例如：

一大批图片，需要把它们的象素调整到一个较小的值以便上传到网上。

一大批图片，对每张图片进行一个扣背景的操作。

这些简单的操作虽然只需点几下鼠标，但乘以 100 就费事了，作一个宏操作，处理每张图片只需按一次快捷

键，就省事多了，还不容易出错。对于分析免疫组化图片这样的复杂操作，制作一个宏来进行分析，节省下来的时间就更可观了。

首先是在所有待处理照片中挑选一张有代表性的典型图片，进行仔细的选色及分析测量。得到满意的结果后，就可以按照这个既定的操作程式进行宏的编制了。

以下面的免疫组化照片的分析测量为例。处理顺序是:

1.点开 count/size 窗口，点 measure--select measurement 菜单，选择 Area、density(mean)及 IOD 三个测

打开图片后

量项目，不使用测量过滤。class object 标记为标记 class 颜色， 2.选择图片中黄色区域作为蛋白表达区，组织空白区域较亮的地方为背景区域。经试验这两个区域都用 HSI 分色选取比较准确。蛋白表达区的 HSI 分色数值为 H:0-28，S 与 I 都是 0-255。背景区的 HSI 分色数值为

H:52-140,S:0-255,I:173-255。

3.先测量蛋白表达区。选完分色后点 count，在 statistics 窗口中把统计数值传入 Excel 中。

4.再回到 segmentation 中选背景区的分色，再次 count，把统计数值传入 Excel。

。测量结束时在 Excel 中有两组统计数值。

在编制宏操作时，因为是自动操作，所以不能有人工选择干预的操作动作。因此要对上面的操作顺序进行一

些适用于宏操作的调整。

宏操作前的准备:

1.把count/size 窗口中各项选择设置完成后，(包括select measurement、class option 设置)点击file 菜单的 save settings 将这些设置保存成一个文件，保存位置最好放在与待处理图片一起的文件夹中。并起一个有意义的文

件名，但最好是英文。

2.再把 segmentation 窗口打开，选好阳性表达区域的分色后，点击下面 file 中的 save file，把这个分色设定也保存成一个文件，也起一个有意义的英文文件名。存完后重新选择背景的分色，再把背景分色设定也保存成一个文件。

3.打开 stistics 窗口，如果打不开的话可先点一下 count 随便测量个数值。然后点一下 file 菜单中的 DDE option 窗口。设置一下测量数据传往 Excel 的规则，这很重要。如果设置不当，你会不知道传过去的数值跑哪里去了。在 DDEoption 窗口中从上到下需要填的选择是:

sheet:Active sheet。这是说数据将存到 Excel 中活动表单中了，还有一个选择是填 sheet 1 。这样统计数值每次都会存到第一页里。

target program:Excel 这是废话，不必改。就这样了。

path: ........ 也别改。里面是 Excel 程序的文件位置，好长呢，别动它。

position data set

row 1 col 1 这是指定数据从 Excel 表单的具体哪个位置开始放，现在的行列值都是一，就是左上角。在测量过数据后，这个行列值会自动地按下面选项的规则递增。如果想让数据重新从左上角开始填，那就必须把这个行列值给改回 1。

再下面是三个单选项:

append next date set to the bottom 下一组数据放在前一级数据的底下。 append next date set to the right 下一组数据放在前一级数据的右边。 imcrement position for naxt date set by

row __ col ___ 这个更灵活，只要填上几行几列，下一组数据就移动几行几列存放。如果行列值都填为 0，那么每次都会存在同一个地方。后面的数据会覆盖前面的数据。

设定了 DDE option 后，不要关闭 statistics 窗口。让它留在那。这样 DDE 的设定就不会悄悄地变化了。

制作宏的操作：

一、准备工作： 1。进行光密度较正。命名保存，如 system。 2。在 count/size 窗口中设置：

measurement:area(10-10000000),IOD(0-100000000) option: outline:none, label style:none .clean border:none

然后点 file --save setting，保存该设置为一个文件 date.evn，文件位置最好是分析的图片文件夹里

3。在 select color 里选 HIS:H 0-30,S,I0-255，然后点下面的 file 按纽，save color 到一个 rgb24.rge 文件,也存到图片文件夹目录中。

二、录制宏：

打开图片，点开 count/size 窗口，先随便测个数据，这样可以打开 view--statistics 窗口，可以随时察看测量数据。再打开 intensity caliberation 窗口。

现在桌面上有光密度较正窗口、count 窗口，数据统计值窗口和图片窗口，以此为运行宏的开始。点宏--录制宏，先起个名字，指定一个快捷键。然后开始录制。注意以下的所有操作都只能用鼠标点，不能动任何键。

1。在 intensity caliberation 窗口中选上已保存过的较正曲线名，注意一下曲线是不是正确，特别是 X 轴交点位置是不是刚才较正过的值（如 200 或 240 之类）

4。仍然在 segmentation 窗口中下方的 preview 中选择 all class 和 transparent on white.此时图片上应显示被选中的部分仍是黄色，其他部分被填上了白色。

2。点 count/size 中的 file--load setting，调出刚才保存的 date.evn 文件。

3。点 select color，在调出的窗口中点 HSI，再点 load file,调出 rgb24.rge 文件。

点 creat preview image 复制下这张 preview 图片。

5。在新图片上点一下，再点程序菜单上的 edit---convert to --gray scale8。又生成一张新图片，这是黑白图片了。

点录制宏小窗口的 stop 结束。把这张黑白图片保存。关闭其他的图片，打开 Excel,然后开始录制另一个宏：

1。开始录制后依然先点一下 intensity caliberation 的那个校正。

2。调出 count 窗口的 setting 文件。

4。回到 count 中点 count 按纽。

5。到 statistics 窗口中点 file DDE to Excel.

6。结束宏的录制。

3。点 select range。将 range 范围选为：0-背景值（这个背景值就是在校正背景时得到的值，如 200 或 240 之类）

说明：由于中间会建立新文件，所以这一步的宏操作常出错。只好分成两步作宏操作。宏操作录制完后，处理图象时的操作： 1。打开一个图片，运行第一个宏。得到一张灰度图片。 2。对灰度图片执行第二个宏操作。

4。先打开下一张要处理的图片，再关闭掉上一张图片。（桌面上不能一张图片也没有）

5。开始处理下一张图片。

图片测量数据的处理：测量指标要根据图片的情况来选择。各有不同的选取。可以：

3。在 excel 中把数据转移或抄下来。

仅比较整张图片的 IOD。

有时图片上仅有部分区域有样品，还有大片区域是空白。这就需要另外测量样品区域的 area(sample sum),然

后比较 IOD（sum）/(sample sum area)

单个细胞可以比较每个细胞的 IOD 或者是单个细胞 IOD/单个细胞 area. 这些其他的情况都需要重新制作宏。

比较阳性区域的 density mean=IOD(sum)/area(sum) (这里的 area 是黄色部分的 area)

五、计数

其实在前面的操作中，我们经常是在计数。当我们点击 count 的时候，就是在计数，不过当时的主要目的不是为了计数，而是为了进行一些其他的测量。

我在实际工作中很少用这个程序来计数，原因是---不实用。这并不是软件的功能问题，而是拍摄照片的问题。因为没作过具体的计数分析，因此这一主题写起来就有点尴尬了。只能看看那些功能能用来计数吧。

最简单的数细胞的工具是 measure--measurement 窗口,下图中左边红线框住的工具就是计数的工具。这很象我们在镜下手工计数，认为那个地方有细胞，就在那里点一下作个标记，这样就不会重复数，也不会漏数。当图片中的细胞数目多得一眼看不出有多少个，但同时也不是多得密密麻麻的时候，比如几十个吧，用这招最简单。

好象这样计数不正规呀，最好是电脑点一下就能算出数来是最好的。那还是用 count/size 工具吧。这张荧光镜下照片中细胞闪闪发亮。所以选择计数测量时可以让电脑自动选取亮物体作为识别标志。点一下 automatic bright objects,再点 count。调出 statistics 窗口就可以看到自动计数结果了。可是它数得准确吗?有 156 个细胞?数多了吧?

下一个招数是过滤，把错误计算进去的计数给过滤掉。图片中的细胞都有一定大小，那些只有几个像素的小绿点显然不是一个细胞。因此可以对每个 object 的面积大小进行过滤，小于一定面积的就不是一个细胞。

调出 count/size 中的 select measurement 窗口，点一下中间 filt range 窗口中的 area 再点一下下面的 edit range 按纽，调出来 edit range 窗口。

在这个窗口里上面有一个范围选择图表，表内左右两端各有一条竖线，分别是范围选择的上限和下限，可以用鼠标拖动的，把这两条线往中间拖，就减小的选择范围。此表的横坐标数是面积的象素值，纵坐标是对应像素值面积有多少个 object。

图表下面有两个数值选择框，是两条选择线的具体数值，也可以在这里选择过滤数值范围。再下面是统计数据，可以动态地看到过滤后的计数统计结果。

display filled 是显示图片中的 object 标志的，如果选中此项，每个选中的 object 都显示成一个红巴巴，否则就只用边缘线框起来。

图中可以看到，如果把面积下限定到 100 象素，就只剩下 16 个细胞了。当调整过滤数值时，图片上的 object 标志也会动态地显示，过滤掉的 object 会立即消失。

还有问题。

图片中有两个细胞紧挨在一起的，被识别成一个 object 了。而另外还有细胞因为太暗，被识别成两个甚至更多的 object 了。

这只能用人工把它们分开或合并。

在 count/size 窗口的 edit 菜单下，上面的几个 split 命令就是用来分割连在一起的 object 的。 auto split 与 watershed split 都是自动分割，操作简单，但很少分成准确。

split 是手工分割，点此后出现一个小窗口，用鼠标在相连的两个 object 的连接处划一条短线，将两个分开，

再点一下右键就行了。把图片上所有相连的 object 全分割后再点一下小窗口的 OK 按纽。再回去 count 一遍，分割就生效了。

limited watershed split 也是手工法分割。这种分割方法是半自动的。道理有点象涨大水。两个挨着的山峰，在山脚处是相连的，如果山下涨了洪水，这两座山峰就会彻底被水隔开了。但是水涨多高才能把两个山峰隔开呢? 这个 limited 就是让你自己掌握涨水的程度。以便分割得更准确。按照说明书的意思，需要输入的数值是涨水最多淹没多少象素的数值。

有挨在一起的细胞，就有一个细胞被识别成两个以上 object 的。用手工将它们合并的命令是 Draw/merge objects。这跟 split 的操作类似，只是不划线，而是画一个圈，把几个本应在一起的 Objects 围起来就行了。

看到这里，是不是觉得很麻烦?鼓捣了半天，真还不如在显微镜下拿着计数器去数呢。

其实这里的问题在于拍摄照片，如果能拍摄出清晰的细胞照片，没有渣点，细胞分布也很均匀，用 IPP 来数密密麻麻的细胞还是能作到的。如果图片中有两类不同的细胞，IPP 也能进行分类计数。class 的意思就是分类。但前提是照片中的两类细胞得有明显的区别，比如颜色不同、大小不同或亮度不同。这个麻烦事以后再谈吧。

刚才的图片中有一些比较暗的细胞没有被计算进去，可见 auto bright object 并不灵验，还得用 segmentation 工具来选色呀，看看这回的计数效果吧。具体作法大家当作作业自己试试吧。我是用吸管工具来选色的，

这张图片大家很熟悉吧?里面有红绿两种颜色的细胞，可以用分类计数的方法同时对两种细胞进行计数。计算结束是看 range statistics。里面给出了两类细胞的计数比例。

六、校正标尺

校正标尺的作用有二：一是把图片几何数据的象素单位转换成实际的长度单位，这样可以得到实际的几何尺寸测量数据。二是在图片上标上一个长度标记。在你打算学学一标尺的操作并自己动手在自己电脑上玩玩标尺之前，要确认自己是要动真格地学会怎样设置这些东东。因为一旦标尺设置错误了，以后所有的几何测量数值都会出错的。而且不会因为你关闭程序或关闭电脑就能 Reset 了。如果你因为在这里学着定标尺而搞乱了你的 IPP 程序，可别埋怨我。

在前面的帖子中我一直没提及标尺。因此在提到测量面积直径等几何尺寸时都用象素作为单位。如果你需要测量微观物体的准确几何尺寸，那就得进行标定操作后才行。还有一个需要标定的是光密度。这可就比几何标尺困难多了。在分析光密度参数时，较正光密度曲线是必须要作的。否则在进行灰度分析时肯定会出错。我在后面重新写了一个相关的帖子。不过本论坛里曾有人讨论过相关的内容。

标定标尺还需要有个物质准备，就是得有一个叫\"微标尺\"的小玻璃片。上面刻有准确的刻度，在 1MM 的长度上刻着 100 个分度刻度，这样这个小尺的每一格就是 0.01MM。得在专业的显微镜生产商那才能买到，或者在买显微镜时把这个当作附件给买下来（就是有点贵，实际上，那是相当地贵）。

如果没有这玩艺怎么办?还真有点难办。照理说如果有一个能放在载片上的尺寸已知的小东西也是可以的，这个东西首先得足够小，其次得准确知道它的尺寸。我现在能够想到的东西就是血球计数板。它的尺寸就是 1 平

方毫米，分了几个大格和小格，大家可以自己算一下或者查一下这些线条的间距。线条精度虽然比不上微标尺，但误差也不会太大。可以凑合着用。上面说的是使用显微镜照片时用的标尺。如果你处理的是大个物体的照片，那就在物体边上放个米尺就行了。在拍摄物体的同时也把米尺的图象拍下来。

使用标尺来标定几何尺寸的方案是这样的: 先用显微镜拍摄下微尺的图象。再用显微镜拍摄下样品显微图象。最后用微尺的图象来\"量\"样品图象的几何尺寸。

在 IPP 中，程序先记住 1MM 相当于多少象素，然后测量样品图象的几何尺寸时只要先算出象素值，一换算就得了。

最重要的一点就是，现在的数码相机都有无级变焦，可以任意放大缩小画面。因此要特别注意，在显微镜下拍摄微尺图象与拍摄样品图象时，绝对不能调节相机的变焦(ZOOM)。

显微镜一般都有 4 倍、10 倍、40 倍、100 倍甚至更多物镜。可以分别用这些物镜拍摄下不同的微标尺图象，在处理不同物镜下拍摄的照片时使用各自对应的标尺。

具体的操作步骤如下: 使用标尺的第一步就是拍摄微标尺的照片。拍一张是不行的。

如果你的显微镜有 4 个物镜分别是 4X、10X、40X、100X。那么就要分别拍摄下这四个镜头下的标尺图象。如果你的像机是非变焦镜头，还不错。不用管变焦的事。我的相机有五级变焦，其中光学变焦三级，数字变焦两级。而三级光学变焦中，两个短焦距变焦拍摄的图象亮度不均匀，不能用。数字变焦不予考虑。因为我固定使用一个焦距。否则每个变焦都要拍摄标尺照片。

数码相机拍摄画面还有不同象素。分别是低、中、高三个档次。三种象素画面大小是不同的，因此也要分别拍摄它们的标尺图片。

4 个镜头，五种变焦，三种象素。共需拍摄 4*5*3=60 张不同的标尺图片。我偷懒，只拍摄 4 种镜头下各自的标尺照片，相机变焦与象素选择都只用一种。如果你的相机是无级连续变焦的，可得小心，得固定一个变焦值。

图中分别是 100X、40X、10X 物镜下的微标尺照片。

设置标尺的菜单命令在 measure --- carlibration -- spatial。

弹出标尺标定的菜单来。

1.点击菜单中的 new 按纽。新建一个标尺，然后再最上面 Name 项下的 spatial cal 0 处点一下，改成 40X-

lowR。这是新建标尺的名称。虽然名称是可以随便取的，但最好能反映拍摄条件，40X 表示物镜为 40X，

lowR 表示数码相机采用最低象素画面格式。别用中文字符。

2.在 UNIT 项下填入 um。这是标尺单位，显微镜图片用微米来计量长度单位最合适。当然可以用别的，比如

KM 作单位，图片上一个小尺的长度就是几千万分之一公里。

3.unit 下面有一个 convert when change unit 选项，给勾上。

4.点 pixels/unit 框里的 image 按纽，就立即弹出 scaling 对话框，同时在标尺图片左上角显出一个标尺，将

鼠标移到这个标尺的横杠上，点一下左键，光标就立即变成了小手，就用这个小手把光标拖下来，再将光标分别移到移到横杠的左右两端，用左键拖这两个端点到图片两边的标尺该线处。

在这一步操作中，两个端点位置必须准确。一个方法是点 scaling 中的放大镜按纽调出放大窗口，可以看到鼠标所在处的放大图形。另一个方法是把标尺的两端放在短刻线的线头处，这样选点更准确。从下图的两个放大镜图象中可看出，端点在刻线中间时上下位置是没法选准的。而在刻线头处，上下左右都有参照，可以准确选中位置。

在选端点位置时要尽量向两边拉，拉得越远，误差越小。 5.左右端点都找好位置后，数一下两个端点之间有多少间隔，这个微尺每格 10um，两端点间为二十小格，长度为 200um，所以要在 scaling 里填上 200。 6.点 OK 关闭 scaling 窗口，回到 spatial carlibration 窗口。

大功告成了。点 close 关闭窗口结束。

如果你觉得这个标尺作得不对，得重作，可以重新打开窗口，在 Name 中选出这个标尺，点 image 重新找端点。如果觉得不保险，就干脆点 delete。关闭窗口，再打开它，刚才那个标尺就没有了，可以重新新建标尺。

重复上面的步骤，把 10X 与 100X 镜下的标尺也给标定一下。

窗口下面的几个选项都不要动它，保留默认值。那些是较正图象变形用的。谁敢说你用的显微镜或照相机有图像变形，厂家会跟你急眼的。至少我现在用的 olympus 显微镜图象没有一点看得出来的变形。设定了标尺，就可以在图片中应用它了。

1.点 measure -- carlibration -- select spatial。或者点工具栏里的卡尺图标，就调出了标尺选择窗口。

2.在下拉框里有已存入的标尺列表，点适用的那个。这样就完成了标尺的第一个作用：应用了此标尺后，测量出来的几何数据就不是象素了，而是实际的几何测量值（微米、平方微米等）下面再使用标尺的第二个功能：往图片上加标尺标记。

点击 marker 按纽(不是点 OK 按纽)。这回弹出的是 spatial calibration marker 窗口。

3.在左上角的 style 有两种标尺外观的选择。这两种选择的后续操作步骤居然不一样!!!区别在于：一种标尺是”

烧进“图象中的，加上标尺的图象已经被改动了，另一种标尺是浮在图象上的，只能在 IPP 程序中看到，在别的程序中是看不到打上的标尺的。具体方法下两帖单独讲。

4.还要选择往图片上标示的小尺长度。长短要合适。如果尺的长度小于标尺文字(10um 这几个字)长度，会很难看的。需要多试几个长度。择优录取。这里还有一个显示比例的问题，IPP 程序对于各种大小的图片，会自动改变显示比例的。特别是大象素的图片，会缩小很多倍显示，这样打上的标尺也会缩小显示，结果是标尺显示得不清楚，其实如果按照 100%比例显示图片，标尺就会清楚了。

5.用”烧入“方式的标尺一旦打上图片，就消不掉了，所以标记上标尺的图片最好另存一张。

6.拍摄标尺的照片与拍摄样品的图片一定要选用同样的象素大小!!切记切记!!否则长度肯定会标错的。

当 Style 样式选用的是 ON-image 时，下面有四个不同的小尺形式。从中点一个选上，再选好小尺长度，点 OK 会弹出一个新窗口，图片中也会出现小标尺。它的位置就是上次选标尺的位置。平时我们喜欢把小标尺放在图片下方，所以这个小标尺经常是出现在图片下方的。继续点 continue 回到标尺选择窗口(Active spatial calibration),现在就可以点 OK 关闭(可不能点 marker 按纽)标尺选择窗口了。

从小标尺出现在图片上的时候开始，直到现在，你都可以用鼠标左健拖动小标尺，移动位置，到位后点一下

右键就把它给定住了。至此就永久地标上了小标尺了。

如果作错了哪一步想从头来，得先关闭图片(一定要选择不保存)，关闭全部窗口，再重新来一遍。

当 Style 样式选用的是 Non-destructive 时，下面有三个不同的小尺形式。从中点一个选上，再选好小尺长度，还可以自选标尺的颜色(这是上一个方法里作不到的)。点 OK 进入下一步。

现在出来一个 continue 窗口，标尺及其文字也出来了。现在别着急点 continue.在标尺上用左键点一下，再

用左键拖，把它移到位。文字与标尺是分别拖的。这样文字的位置可以灵活地放。标尺和文字都拖到位后再点 continue。一旦点了 continue,就不能后悔了。

回到选择窗口后点 OK 关闭。

光看这些啰哩啰嗦的说明肯定记不住。只能自己操作几遍才行。IPP 的标尺功能好象有点 BUG，有时候真的不灵。打上的标尺很难看。这是因为不管图象的实际大小，显示的图象几乎都是那么大，如果是一张大图片，因为显示时图片被缩小了，所以标尺也被缩小了，结果看上去文字与标尺本身都显得小而不清晰。其实如果用实际象素来显示图片的话，标尺就会清晰了。

如果你在 IPP 中设定了标尺。就一定要设对。否则所有的计算结果都是错误的换算数据。

时它还是自动地应用这个标尺。

而且 IPP 的记性非常好，即使你关闭程序了，关闭电脑了，它还是记得你设置了一个标尺，下回你使用 IPP

所以每次开始使用 IPP 的时候，一定要点一下工具栏里的卡尺按纽，选择一下标尺，如果不想应用标尺，就一定要选 none。总之一定要选一个。即使你不想在图片上打标尺，也要选一下，因为各种几何测量的值已经被这个标尺设置给换算了。设定了标尺后，几何测量值就不是象素值，而是换算成微米值了。

所以如果你一旦动过 IPP 的标尺设置，就一定要把这个主题给看明白，学会。否则你的数据几乎肯定会出错的。而且经常是错了还不知道错在哪里。

七、几何测量

在上一主题我讲了设定标尺的方法，设定了标尺后，还要选择定义标尺，才能测量几何尺寸。因此在这一主题里的几何测量中，首先定义标尺是必须的。定义标尺与在图片上打上标尺记号是两回事。定义标尺的操作并不在图片上留下任何痕迹。但所有测量数据却被换算成实际的长度数值了。而在图片上打标尺记号的操作也就自然地定义了标尺。

实际上在前面的 count/size 中的 measure 中，我们已经作过许多几何测量。比如测量各个 AOI 的面积，平均半径，长宽比例。在那个 select measurement 窗口中除了一些光密度测量项目外，还有一长串的几何测量选项可以运用。

你们是否注意到，所有这些几何测量项目都有一个共同的因素----都是测量一个区域的几何尺寸。因此，在点、线、面、体这四个方面，前面所能作到的测量只包括了面的测量。所以我们还得知道一些点和线的测量方法。至于体的测量，现在还不敢想。呵呵。随便打开一张图片玩吧，点 measure -- measurements。主要的测量工具就在这里了。左上角的 features 框里就是这个工具能作的测量。最下面居然也有 count/size。可见软件商对这个 count/size 工具是多么得意。在这个框里找个测量项目点一下，就出来一个小对话框指导你该怎么操作。我挑几个有意思的说说。最上面的点工具我们用过吧。其实那不是为了数数用的，而是测量点的位置的。用它在图上点一个测量点后，这个点的坐标就在旁边的窗口里显示出来了。

当你点曲线按纽时，出来的工具与 AOI 的 irregular 工具一模一样。只是在选 AOI 时，它一定会走一个闭合曲线。这里它可以走一个任意形状的曲线，也是可以自己拖，可以循边界自动找。在自动找线时要先点左键让它停下来，再点右键确认。

量角度的两个工具有啥区别?前一个画着角线的工具是让你在图上自己画两条直线，测其角度。量角器那个工具是量图上已经有的两条线之间的角度。那些\"已经有的直线\"得是用上面画直线的工具画上去的。倒数第二排的测两条线之间的距离的工具也是需要先用直线或曲线工具先在图上画好两条线后才能使用。

IPP 也有说话不算话的时候。比如画点拟合线时可以画上很多点，然后点右键就出来了拟合直线。画点拟合园或弧的时候分明说的是可以画三个以上的点，结果点三个点就立即出来一个园或弧。

当你用这些工具在图片上画了一堆乱七八糟的线条后，只要点一下上面的叉按纽，就能消除掉它们了。

右边显示的测量数值也可以传到 Excel。在 output 项下就有 DDE to Excel 命令。

八、图象分析策略

有了图象分析软件，该怎么应用它来分析工作中的图片呢?这就涉及到图片分析的策略。这并没有一个权威的或者是已经有定论的方法。因此我在这里只能讲讲我自己作过的一些显微镜图片分析处理的方法。从我自己的体会来说，几乎每一项分析其策略都不同。我也不敢说自己的作法就是正确的。也没有多少文献可供参考。比如免疫组化染色图片的图象分析方法，查过一些文献，提到图片的数字分析处理时往往就几句话。有许多还是用图象分析仪测量的。我怀疑他们自己也没弄明白具体的分析策略是什么。

有人是这样作的:

使用正园形 AOI 工具，在一张免疫组化图片上随机选取五个位置，分别测量这五个位置上这个正园形区域的平均光密度，得到一个平均光密度值与标准差。我认为这样作是错误的。因为这个平均光密度值的真值就是这张图片整个的平均光密度值。因此只要选一个矩形 AOI，大小就是这张图片的尺寸，其平均光密度值就是刚才那个平均值的真值，没有标准差。

要作好免疫组化图片的数字分析，从拍摄显微镜照片时开始就要考虑操作细节了。作切片时要保证各个切片条件的一致就不说了。在使用数码相机拍摄切片照片时得注意什么呢?

1.显微镜的亮度要前后保持一致。这包括电源的电压要稳定。最好给显微镜加稳压电源。光源亮度调节在拍摄一组照片的过程中不能动。聚光镜也不能调。

2.数码相机不能用自动调节设置，全部用手动设置。包括曝光时间、变焦、光圈。还有一个很多人都想不到的地方:自动白平衡功能要关掉。前面的照片中有几张看上去背景是浅蓝色的，这就是数码相机的自动白平衡功能在起作用。因为整个画面都是黄色的染色，相机就会认为画面色温偏低，要进行一下较正，给加点蓝色吧。浅蓝色背景其光密度与浅黄色的阳性区域差不多，这样就给准确测量光密度带来了更大的误差。 3.拍摄荧光照片时自动曝光所带来的影响更大。前面有一张荧光照片，是从本论坛里找出的。这张照片曝光过度了，结果是最亮的几个细胞呈现出了黄色，而不是它们本身的红色或绿色。另外在细胞周围出现了光晕，给数字处理时的选色操作带来了困难。在选取 AOI 时不易选中准确的细胞界线。 4.在拍摄荧光照片时阳性细胞的光强度很大，阴性细胞光强度很弱。如果都用自己曝光拍摄，相机自己调节曝光时间，结果使者在照片上呈现出相同的光强度，这还怎么分析呀? 5.在拍摄双染色荧光切片时，如果要分析两种荧光各自的光强度，还在用单色 CCD 分别加各个染料的滤光片分别拍摄其单色照片分别分析比较准确。用彩色相机拍摄时问题会出在同一个位置两种荧光都有的地方，在彩色照片上这里会呈现出第三种颜色，数字照片的格式似乎很难分清这两种荧光在这里各占多少比例。也许还是举个例子来讨论一下分析策略吧。

从直观来看这些切片图象，处理后切片整体感觉其\"黄色\"越来越浓。正常组织也有一点黄色的地方，而阴性对照组织则一点黄色的地方也没有。

分别测量一下各个照片整体的平均光密度(density mean)。

191 170 175 163 155

阴性正常一天三天五天

看上去用 density(mean)测量其平均密度就行，各个片子之间有差异。可是把各组切片都这么测量一下，问题就来了，别忘了每组有十来张切片，其光密度值各有不同，因此进行了统计学处理后发现，除阴性组以外，其他各组之间并无显著性差异。

看来简单地测量整张图片的 density mean 是不行的。

下一个招是测量图片中黄色区域的累积光密度(IOD) 阴性组几乎没有黄色区域，IOD 很小。正常组也有黄色区域，与一天组、三天组之间，IOD 没有显著性差异。五天组的实在是太\"黄\"了，其累积光密度与其他组有显著差异了。

其实图片中细胞间隙的背景也是有一定光密度的，测量一下，它的密度值与阳性区域差得还真不太大。这个密度值应该被扣去。

再加一招，计算每张图片中的: 阳性区域光密度值-(阳性区域中阴性部分光密度值)=

阳性区域 IOD-(阴性区域 density mean) X (阳性区域 Area)

式中阳性区域 IOD 是照片统计数据中 IOD 的 SUM 值。阴性区域 Density mean 是阴性区域 density (mean)的

平均值。阳性区域 Area 是 Area 的 SUM 值。这回各组之间的差异就表现出来了。

不过这个策略是否正确，我也不敢较真。这些照片的背景是浅蓝色的，说明照片拍得还不够理想。这种扣背景的作法是否合适呢?

九、其他有趣功能

进行完图片分析处理后，IPP 在图片上标记了各种 object 的标记，比如把选中的细胞标记上 calss color，还可以在每个 object 上标记上 object 的序号或者测量的数值。这样的图片很好看，如果你想保存下这样标记上各种记号的的图片，该怎么作呢?按 print screen 截图是最笨的招。在工具栏上面有个照相机的按纽，点一下它，就能把当前图片的外观给新建成一个图片了。

这是处理黑白图片用的工具，就是以图片上各点的灰度值作一个三维地形图，挺好看。最适于对电泳图片作这样的处理，哪有有条带能看得一清二楚。

窗口中有六个卡片，主要得设置一下视角，让地形图能看得清楚，最后输出一个新图片。这个功能只对黑白图片有用。彩色图片的效果不好。

这种切片真闹心，因为切的厚度大且不均匀，在高倍镜下有的地方聚焦清楚，有的地方不清楚，如果把另一个地方对焦清楚了，这里又不清楚。

在 IPP5.1 里还真有好东东，能搞定这种切片。正象那些保健品广告词里所说\"真的有效吔\"。

3.从现在开始，把载物台向上升一点，照一张照片。具体操作时可以转焦距微调纽，每次只转几度。直到全部画面都变虚为止。

1.首先在显微镜下仔细调整焦距，先将载物台降低，直到所有景物全都虚焦。

2.然后一点点向上升载物台，直到画面中有一小部分物体图象清晰。照下第一张照片。

这样就照下了一组不同对焦的照片。 4.在 IPP 中同时打开这一组全部照片。

5.点 Extended depth of field 命令。调出这个窗口。

1.把中间那个 add all 按纽点一下，选用所有这些照片来合成一张清晰照片。 2.点 focus setting 卡片，设置合成参数。

3.在 output option 中选上面那个 generate compusite best focus ...

在 fucus analysis option 中先中间那个 maximum through-depth cont 最下面还要勾上 generate topographic....

4.点一下 teststrips 按纽，屏幕与电脑会立即抽起疯来，别害怕，等它安静下来，会出来一个黑白图片，还有一个序列照片播放窗口，这些都不用管它。

5.最后点一下 creat 按纽，出来一个新的合成图片，真的很清晰的。这个功能看来很实用。好象是照的图片越多效果越好。如果老板有钱买个电动对焦显微镜，那就更厉害了。

自己一张张拍的连续照片当然相互之间差异稍大，如果是用 CCD 连续拍 sequence 照片能更好一点。在荧光拍摄中，还有用 CCD 拍摄荧光单色照片，然后再合成的作法。这可不是雕虫小技，而是先进的荧光拍摄技术。我没用过，就不敢吹牛皮了。等老板买了激光共聚焦显微镜，估计就得用上这些功能。

到此我已经黔驴技穷了。各位在使用 IPP 时还有什么绝招和心得体会，也请你们来说说。我这些就当是抛砖引玉了。再次恳请大家对我帖子里的内容提出批评建议。特别是我说错的地方一定要指出，以免误人子弟。谢谢大家的支持。

十、光密度

我在前面曾经说过光密度较正很难作得准确，吃力不讨好。因此想回避它。但最近却发现这个问题回避不了。只好老老实实地再琢磨一下。真的很伤脑筋，其中有些问题也是百思不得其解。只能把基本上弄明白的地方先给讲解一下。这样大家在看的时候可就费力了，真是不好意思。其实我觉得给别人讲解就是一种最好的学习方法。能够给别人讲解清楚了，才是真正弄明白了。

在计算光密度过程中出现的问题来自于图片的光强单位与测量中的光密度单位的不一致。在计算机的图片格式中，一点象点的\"亮\"与\"暗\"是通过定义相素点的\"灰度\"来实现的。纯黑的点的\"亮度\"为零。定义其灰度 gray=0。纯白点的\"亮度\"为 255。定义其灰度 gray=255。

光密度则是光学测量中的概念。OD 值(optical density)叫光学密度，定义为吸收光线物质的光学密度，它与该物质的物理密度应该是线性相关的。OD 值与透过它的光强之间的关系符合朗伯-比尔定律，是指数关系。当 OD 值等于 0 的时候，对光线无吸收，透射率 100%。对应照片上最亮的部位，白色，gray=255。

当 OD 值等于无穷大的时候，会吸收全部光线，透射率为 0。对应照片上最黑的部位，gray=0

在未进行 intensity 校正的情况下，IPP 用的是 gray 灰度单位。浅色处灰度值大，深色处灰度值小。这样测出的 density 数值是染色深的阳性区域数值小，染色浅的背景区域数值大。这就带来了极大的不方便，很容易就出现错误。

还有问题呢。因为光强与光密度之间是指数关系。在光密度不大的时候(阳性区域染色浅)阳性区域的 density 数值与背景 density 数值都处于较高水平，相差很小，作了减法以后误差增大，扣背景时就会出现极大的误差。而且造成统计数据的效果混乱。

当我们使用 IOD(累积光密度=area * density_mean)表达切片上阳性物总量时，如果错用了灰度值。IOD 的数值与染色深浅就成了负相关，也就是染色越深，IOD 反而更小，但同时，面积越大，IOD 仍然越大，这个错误的 IOD 值就根本不能反映\"照片上阳性物质总量\"了。

因此在作光密度分析时必须对程序系统的光密度值进行转换，从灰度数值转换为光密度数值单位。在平时，很多人并不清楚灰度与光密度之间的异同，甚至在发表的文献上也是胡乱使用这两个不同的概念。由上面的分析我们可以看出，实际上灰度是我们用电脑进行图象分析时所用的中间变量。而光密度才是我们真正需要使用的单位。

我们是通过对照片的灰度进行分析来测量样品的光密度的。

在未定义光密度校正的情况下，density mean 与 IOD 的数值实际上都是照片的 gray 值。gray 与 OD 值的换算公式就是朗伯-比尔定律。是指数关系。我们进行光密度校正的目的就是让照片上亮的、白的、染色浅的点的 OD 值显示为接近于零的小的数值，让暗的、黑的、染色深的阳性区域点的 OD 值显示为较大的数值。

对于光密度的校正有两个层次。第一个层次是按照照片的灰度值直接换算。灰度为零的换算为无穷大，灰度为 255 的换算为 0。

第二个层次是考虑到照片的实际情况，把照片最\"白\"的地方(灰度值小于 255)定义为 OD=0。这实际就是一个扣除背景的操作。相当于在分光光度计上调整\"100%\"点再把照片中最\"黑\"的地方定义为一个大于零的值。一般定义为 2.0(定义为无穷大是作不到的)。或者用标准样品的光密度点直接定义其为样品浓度的值。这相当于在分光光度计上定义零点和标准点。校正光密度的具体方法如下 :

1.点 measure - calibaration - intensity....(得先打开一张图片才行) 出现的窗口

2..点窗口里的 new 按纽，新建一个 caliberation set，在下面点击 std optical density。再点一下左上方的 system

按纽。这个 system 是一定要点的，否则这个光密度较正的设置就只作用于这一张图片，对其他的图片不起作用。

3.点 close 就完事了。这就完成了第一层水平的光密度校正。以后进行光密度分析时，使用的单位就是真正的

里是空的。注意窗口第四行有一段文字:no system caliberation set.

optical density 了。测量的光密度数值与样品浓度呈正比关系。而以前的灰度值是与样品浓度成指数关系的。 4.进一步的校正应该是对\"白\"点与\"黑\"点进行定标。定黑点时需要有标准点。可以在切片上帖一片全黑物体，作为标准，或者是定量浓度的样品点，可指定其为浓度的单位。这一点往往作不到。不作也罢。测个相对值就是了。

定白点实际上就是扣除空白、扣除背景。把图片上最浅的地方定义为 OD=0 每张照片上这个值都不会一样的。难道每张照片都要这么来一下吗?不必。在一组照片中，背景虽然不一样但不会差得太多，找一个最大的(最亮的)设为其公用的背景值也是可以的。

点 option 按纽，在弹出的小窗口里有 black 与 intensity 两个设置。black 就让它为零。点 intensity 旁边的

image

按纽，到图片上最\"白\"的地方点一下，看看值是多少，最好在一组照片的每一张最白处都点一下，看看它们的值相差多少。然后选其中最大的数值填入。OK 后可以看到光密度曲线的终点由 255 变成了你填入的值。

还是作个实例来分析吧。这里有一组八张照片，左边四张是阴性，右边四张是阳性。阳性样品切片染色深。

optical density

1a 400 density mean = 0.06397654 IOD sum = 20145.209 阳性 1b 400 density mean = 0.08162043 IOD sum = 31614.428 阳性 1c 401 density mean = 0.0463396 IOD sum = 19741.533 阳性 1d 401 density mean = 0.0569243 IOD sum = 22324.918 阳性

2a 400 density mean = 0.04021387 IOD sum = 7237.6157 阴性 3a 400 density mean = 0.0427474 IOD sum = 5851.5864 阴性 4a 400 density mean = 0.03572424 IOD sum = 6247.9492 阴性 4b 400 density mean = 0.02794417 IOD sum = 5908.3018 阴性

P= 0.033001713 P= 0.008077167

gray level

1a 400 density mean = 164.25151 IOD sum = 21893180 阳性 1b 400 density mean = 154.83362 IOD sum = 24106100 阳性 1c 401 density mean = 173.0679 IOD sum = 24422198 阳性 1d 401 density mean = 170.82968 IOD sum = 22868880 阳性

2a 400 density mean = 180.78764 IOD sum = 24721144 阴性 3a 400 density mean = 180.44046 IOD sum = 18576882 阴性 4a 400 density mean = 210.87852 IOD sum = 16926544 阴性 4b 400 density mean = 188.02229 IOD sum = 19494658 阴性 P= 0.034035015 P= 0.135092458

用校正过的 optical density 测量数据进行统计分析，density mean 的差异，P 小于 0.05。而 IOD 的差异，P 小

于 0.01。结论是两组照片有显著性差异。用 IOD 更有效率。

直接用未经校正的 gray level 的测量数据来分析，density mean 的差异，P 值小于 0.05，数值上略有差别。但 IOD 却变得没有差异了! P 大于 0.05。这是为什么?

IOD 是阳性面积与阳性平均光密度的乘积，应该是面积越大，IOD 越大，光密度越大，IOD 越大才对。现在光密度的值是反的，阳性越大，光密度的数值越小，IOD 值反而变小，这不是全拧了吗?

可见光密度的校正是必须要作的。至少要作第一层水平的光密度校正。对于背景较暗的要进一步校正\"白点\"。如果各张照片的亮度差别大，就得分别较正每一张照片的\"白点\"了。在这个实例中，我是把全部照片的白点都定义为 210。

是否要扣背景?这还真不一定。也许扣了背景以后，能使两组之间的差异更明显，也许作不到这一点。这与照片本身有关。

大家一定注意到了火锅的作法与我的作法有点区别。他喜欢把选定的区域转换成灰度图片后再测量。我觉得没有必要。因为彩色图片的 density mean 与灰度图片的 density mean 应该是一样的。不过，最后测量的数值却的确有差异!!

图中左图是从右图中切出的，其 density mean=0.14815767 IOD SUM=16355.301 中

特别是 IOD，转换成灰度图后的测量值居然有 10%的变化。真出乎我的意料之外。不过我觉得这属于系统误差，并不影响测量的整体结论。但我也确实弄不明白这个误差是从哪里来的。

图是从左图变为灰度图，其 density mean=0.14364377 IOD SUM=15671.411

还有一个影响光密度的因素。图中这两张照片是一模一样的吗?

只有一点不同，一张是相机上设置了自动白平衡校正。另一张则关闭了这个功能。

自动白平衡是数码照相机为了保持照片色彩的均衡的功能。使照片看上去不偏色。可是用染料染色的显微镜照

片就偏偏都是有偏色的。它就是需要偏色的。这样数码相机的自动白平衡功能就有点多余了。当你拍摄黄色的免疫组化切片时，相机会认为照片太黄，必须增加点蓝色平衡一下。这就是一些黄色的免疫组化照片上的空白处呈现淡淡的蓝色的原因。这样照片是顺眼了一点，但是背景值的光密度却被增加了，阳性区域的光密度却被减少了。所以拍摄显微镜照片时要关闭相机的自动白平衡功能。特别是要进行光密度分析时，不能使用自动白平衡功能。

自动白平衡功能对荧光照片的影响特别大。

十一、免疫组化光密度测量

我这里说的免疫组化图片，是这样的一类图片：染上的颜色是黄色，如果染得浓，就呈现棕黄色。（制作样品的过程可别问我。我不知道）

要比较不同切片的光密度值来确定它们之间的蛋白表达的差异，首先要注意的就是这些切片样品要用尽可能完全一致的方法来处理。最近看到一个新技术挺不错，就是把各个样品定位后，各切出一个小细条，整整齐齐排成一个阵列，包埋在蜡块中，切成一片切片，然后进行免疫组化反应及染色处理。这样在一个载玻片上就有了数百个小切片，不仅它的的切片染色条件一致，还节省了抗体试剂。

切片当然首先得拍成照片才能进行分析。拍照也是一个重要环节，在显微镜下拍摄免疫组化照片需要注意以下

几个要点：

1.所有照片必须在完全同样的显微镜条件下拍摄，在更换样品时，除了调整焦距和视野外，显微镜上的其他部件都不能动！所有的样品必须一次拍摄完全。特别是在拍摄过程中，不要一会用高倍镜，一会用低倍镜，来回切换物镜。当然，在使用高倍镜时对焦及寻找视野会稍麻烦一点，但也没办法。保持各张切片的拍摄条件一致更重要。

2.数码相机必须设置为手动曝光，并且保持每张照片用同样的曝光条件，同样的曝光时间，同样的光圈。特别要注意的是，一定要将数码相机的自动白平衡功能给关掉！！！

3.免疫组化切片一般染色不太深，因此拍摄出的照片颜色较浅，就让它浅。拍摄出的照片中空白部位应尽可能呈现纯白色。测量其灰度应在 230-240 之间。如果呈现淡蓝色，一般是相机自动白平衡在起作用。另外一个因素是显微镜灯光电压不正确。要使灯光本身的色温正确。既不偏黄，也不偏蓝。下面两张照片中左边一张是合适的曝光，右边那张不好。

打开要分析的图片后首先要进行光密度校正。

点开 intensity calibration 窗口后，选 std option density，并点 option 按纽，在弹出的窗口里点 insident

旁边的 image 按纽。弹出第三个窗口后，将鼠标移到图片的空白处点一下，就可以看到 current value 的值会显示出点击部位的灰度值。白色的背景能达到 250 左右，而拍得较暗的照片或者背景偏蓝的照片则只有 200 甚至更低。

一张照片的背景强度不会是完全一样的。所以要在照片各个不同的空白处都点一下，看看它们的值差别大不大。许多相机拍的显微镜照片是中间稍亮，四周暗。所以最后确定的背景值只能是取它们的折中。较正背景的值会在曲线的 X 轴端中表现出来。

最“正确”的方法是把所有组织块全部作成切片，再拍摄下全部照片，对每张照片都进行测量统计。当然这是不可能作到的。所以要进行“抽样”。把组织块切出一个或几个切片，作免疫组化染色，这几个切片再次抽样，拍摄出几张照片。对这几张照片进行测量统计。

楼上所提及的问题，涉及到的就是“抽样”的方法。首先要观察切片的整体特征，阳性细胞的分布是随机性的还是有规律性的。一种可能是所有的切片都有一个共同的特征，就是在脊髓的某一个部位阳性细胞密度会高于其他部位。这时候对所有的切片都应该取这个位置拍照片。另一种可能是细胞密度分布是无规律的。随机的。这就需要随机选择拍摄位置照几张照片，然后取平均值。这个平均值是把每张照片的 iodsum 全部加起来，然后除以照片的张数。不是简单的算术平均。如果每张切片都是拍摄四张照片，直接把四张照片的 iodsum 相加作为这块切片的测量值是正确的。

十二、macro

当然，如果你对 IPP 一点也不了解，是使用不了这个 macro 的。特别是看过了第十一个关于免疫组化图片光密度测量的帖子。这个 macro 基本上就是根据这个分析方法来分析测量免疫组化图片的。下载了这个 macro 后，首先用记事本打开这个文件，在第三十几行上找到这句话：

Shell(\"c:\\program files\\microsoft office\\office10\\excel.exe\")然后到你自己的电脑上按照这个路径看看。如果你安装的是 officeXP,则能找到这个 excel.exe 文件。不同版本的 office，其 excel.exe 文件的位置是不一样的。你需要在自己的电脑上找到 excel.exe 文件所在的路径，然后在记事本里修改这句命令，使它能正确地指到 excel.exe 文件。

一般 office2000 的系统要把这句话改为

Shell(\"c:\\program files\\microsoft office\\office\\excel.exe\") office2003 的系统要把这句话改为

Shell(\"c:\\program files\\microsoft office\\office11\\excel.exe\")

改完后直接在记事本里点保存。

把保存好的文件另存到 C 盘 IPP 文件夹下面的 scripts 目录里。

口中选择 pathology。再点 OK 关闭所有窗口。

启动 IPP 程序，点 macro 菜单下的 macro 命令。在 macro 窗口里点 chang 按纽。在弹出的打开文件窗

这个 macro 就安装好了。

再次点 macro 菜单，就可以看到在菜单的最底下增加了两行命令：pathology 和 filloutside。点击 pathology

来运行这个宏。

测量免疫组化图片光密度，实际上测量的就是一个平均光密度 mean density。这就需要先测量一下有效测量区域的面积，再测量这个面积范围内目标染色区域的累积光密度值 IOD。两者相除得到 mean density。作为一个特例，如果测量区域就是整张图片，可以直接测量 IOD 值。不必考虑面积区域。以下图为例。图片中黄色染色区域主要集中于蓝色框住的区域内。测量平均光密度就要根据图片情况有三种选择：

2.测量整张图片黄色的 IOD，除以红线框住区域的面积。（这是扣除空白区域）

1.测量整张图片黄色的 IOD，除以整张图片面积。

3.测量蓝线所框区域的黄色 IOD，除以蓝线框住区域的面积。（这是计算特定组织区域的染色平均光密度）

在许多情况下，都需要选择测量区域，作为特例，在测量区域充满整个画面时不需要考虑测量区域。需要指出的是，使用 IPP 的 count/size 测量 IOD 及 area 时，测量出的面积 area 是选定的黄色染色区域的面积。用 IOD 除以这个面积一般来说是不准确的。它的意思是“黄色染色区域的平均光密度”。所以使用这个宏进行测量时就有两件事要干： 1.画出测量区域 2.选择特定染色物的颜色。

从手把手教你使用 IPP 第十一帖中可以知道，在测量时需要校正光密度、设置 count/size 以及 segmentation。这里也需要作这些事情的。可以在 IPP 里事先把这些设置好，并把设置文件保存到指定的文件夹中（别乱放，建议与待测量的图片保存在一起）。也可以在运行 macro 过程中调试。当然调试时别忘了把设置文件保存好。点 macro 菜单下的 pathology。调出 macro 界面。

再打开一张典型的待测量图片，应用 single measure 调试测量参数。方法是：

1.在 image setting 中选择 measure active image

2.在 measurement envirement setting 中点 OD calibration 按纽，在弹出的光密度较正窗口中作好光密度较

正，保留此窗口在桌面上不要关闭。然后点另一个弹出对话框中的 continue 按纽返回。

3.选中 manually select color range 与 user define area。点 single measure 开始测量。

如果选择了 manually select color range，测量时会弹出 segmentation 窗口，此时可以调试 HSI，然后保存这个颜色设置到指定的文件夹中，同时还要保存 count/size 的设置文件到同一个文件中。如果事先已经有保存的设置文件，可以把它调出来。

完成后必须点一下 count/size 窗口的 count 按纽，测个数看看(必须点，否则后面的计算可能会出错)。

在保存了 count 与 segmentation 的设置文件后，点 setting folder 按纽，到保存设置文件的文件夹里随便找个文件点一下，再点 OK 返回，就可以看到指定文件夹的路径已经显示在界面上了，而且文件夹里设置文件的文件名也会出现在下拉框里。

这些调试也可以另外单独进行，只要保存好设置文件就可以，但是必须要在 macro 运行之前或者运行中测量一次 IOD，看看效果。

如果选择了 user define area，就还会弹出一个 area select 的对话框，此功能是方便选择测量区域的。要使用手动选择 AOI 工具把图象上需要测量的区域一个个的圈出来。有两种选择方式，怎么方便怎么用。

如果图片上大部分是需要测量的区域，只有一小块区域需要扣掉，就选择下面一项：填充 AOI 内部为白色，测量 AOI 外面区域。此时只要用 irregular AOI 工具把需要扣除的小块区域给圈上就行了，程序在测量时会扣掉这一小块区域。有多个小区域要扣掉时则把这几个区域都圈出来。

如果图片上需要测量的区域更容易圈出，就选择上面一项：fill outside of AOI and measure area inside of AOI.

如果测量区域就是整张图片，就啥也不要选。

下图是扣除小块区域的例子

选择完测量区域后程序就会测量出这个区域的面积与 IOD，并且把测量数据送入 excel。可以到 excel 中看测量结果了：

Optical desity measurements report

Macro started at Date/Time: 06-10-31 / 9:04:25

Image Name / Folder IOD(SUM) AREA(SUM) Mean Density

A-24-2.tif/Active 5785.524 290570 0.019911

在 excel 中的数据，第一列为图片文件名，第二列为 IOD 测量值，第三列是选择区域的面积（单位为象素）。第四列就是 IOD/area。

此时一定要检查一下测量值是不是正确。常见的错误是：光密度较正没有应用上，导致 IOD 测量值特别大。选色文件没有调用上，测量出的 IOD 值几乎等于 0 甚至就等于 0。

测量单幅图片是一定要先作一次的，主要是检查一下整个测量过程是否正确，各个测量设置文件是否正常应

用了。当然如果需要测量的图片很少，就这样一幅幅测下去也是可以的。

在 analysis and report 框中还有两个选项，一个是在测量时创建一幅带有标记的图片，需要的话就可以选上。另一个是调试程序时需要看看中间过渡图片的，一般不必选它。调试好各项设置文件之后，下面就可以对所有图片进行批量处理了。不过有一件事是没法自动处理的，就是每张图片的测量区域都不一样。还是需要一张张地画。

可以这样作，在 photoshop 中或者在 IPP 里先把所有图片中测量区域以外的地方都填上白色。然后再回到这个 macro 里进行批量测量。在批量测量时，程序会自动把测量区域定为非白色的区域。如果测量区域就是整张图片，就不必进行测量区域的选择。

在 image setting 框中选择 measure all images in forlder。再点旁边的 image folder 按纽，到保存图片的文件夹中随便找个文件点一下。返回。

再到下面的 analysis and report 框中，可以看到 single measure 点不动了，而另一个 batch measure 却变黑了，点这个按纽，程序就开始一幅幅地测量指定文件夹中的所有图片文件了。上百张图片一会就能测完。真省事呀。批量测量图片时如果把 segmentation 与 count 的设置文件中所有的预览选项都设为 none。那么测量的速度就会飞飞地快。我试过测量了 300 张图片，点了一支烟还没抽完，它就结束了。测量的数据都保存在 excel 表格中。

十三、荧光强度测量

如今，使用荧光染料进行免疫组化染色的实验非常普遍，与前面第 11、12 帖所述类似，荧光染料染色细胞的荧光强度也能反映细胞中相关蛋白的表达强度，自然而然的，大家会想到是否可以通过 IPP 分析细胞或组织切片的荧光照片来分析其荧光强度，并以此来表示相应蛋白的表达强度。

非常令人沮丧的是，这个想法是很难实现的。关于使用 IPP 分析荧光照片，我的看法是： 1.IPP 分析荧光照片是小菜，很容易作。

2.IPP 的分析结果与实际情况是有很大误差的，这个误差不是 IPP 的错，而是在制作样品极拍摄照片的过程中引入的。

所以在介绍使用 IPP 分析荧光照片的方法之前，首先得说说如何拍摄荧光显微镜照片。这可能比 IPP 的操作还要重要。荧光显微镜拍摄的样品，是使用荧光染料染色的，使用荧光显微镜时最重要的，是选择合适的激发光滤光片与荧光滤光片。正确选用滤光片能得到足够强的荧光，但一般情况下，显微镜不可能配齐所有的滤光片，更何况现在的显微镜滤光片价格都很贵，只能求其次，使用波段相近的滤光片，荧光强度稍低一些。粗略的选择是：红色荧光染料，使用红色截止滤光片与绿色激发滤光片。绿色荧光染料，使用绿色截止滤光片与蓝色激发滤光片。蓝色荧光染料，使用蓝色截止滤光片与紫激发滤光片。

更精细的滤光片选择，可以参照下表：

http://home.dlmedu.edu.cn/jcyxy/zxlab/document/FluoDATA.xls

在拍摄荧光照片时，如果要分析荧光强度，与免疫组化照片一样，要确保每张照片的拍摄条件完全一致。先拿一张荧光最强的样品观察调整显微镜。确定相机拍摄的曝光时间。荧光照片的曝光要注意的事项有： 1.是荧光最强的部位不能曝光过度。判断标准是照出的照片在最亮处不能变色。比如绿色荧光照片，当曝光过度时，亮处会变成黄色甚至白色，这就是曝光过度了。过度的曝光会导致测量数值变低。当确定了一个曝光时间后，就必须以这个曝光时间拍摄所有的样品，绝不能使用自动曝光。 2.没有样品的空白部位应是纯黑色。这一点不一定能作到。特别是组织切片，由于样品的散射作用，没有荧光的部位也会显示出一点荧光的颜色的。 3.荧光样品是有荧光淬灭效应的，当把样品放到载物台上后，要以最快的速度选择视野立即拍照。时间越长荧光越弱，其衰减速度与时间的指数相关。这就是导致荧光强度分析误差巨大的最主要原因。 4.使用激光共聚焦显微镜拍摄荧光照片比普通荧光显微镜效果更好，能够更有效地控制所有照片的拍摄条件保持一致。在条件可能时，尽量使用激光共聚焦显微镜来拍摄。 5.在拍摄细胞爬片上的细胞时，将爬片的细胞层向上，放置在载玻片上，然后再盖上一片干净的盖玻片。很多人喜欢把爬片翻过来放在载玻片上，直接在镜下观察，这样并不好。爬片背面沾的培养液不易擦净，导致图象不清晰。 6.许多情况下，在拍摄一张荧光照片后，还需在同一视野下拍摄一张细胞轮廓的普通光照片。由于没有进行正常染色，这不容易照清楚。有个绝招管用：将显微镜的普通光聚光镜往下降得很低，就能照出较清晰的细胞轮

廓照片。

7.由于荧光实际上就是单色光，所以最好使用单色冷 CCD 作为拍摄相机拍摄 12 位或 16 位的灰度图片。不过一般的显微镜现在基本都是使用彩色CCD 的。在设备可能的条件下，要拍摄12 位或16 位的图像。比如Olympus 的 DP70 相机就可以拍摄这样的图片，图片文件会大一点，但对荧光照片的分析是大有好处的。

拍摄完图片之后，在分析之前，还需对图片进行一下转换处理。荧光图片上，表达最强所对应的是图片上的亮处，背景则是黑色的。这与第 11 帖中所分析的免疫组化图片正好相反。所以要先把荧光图片作一个黑白反相处理。IPP 当然是可以作这件事的。其他的图象软件也都能作。如果使用 IPP 来 Invert contrast，一定要记得 Invert 之后还要 apply contrast 一下，否则图片实际上是并没有改变的，它只是显示成了反相。反相后的照片另存到另一个子目录中用于测量，原始照片是必须保留的。这个反相的照片可以是彩色的，也可以是黑白的。最好转换成黑白的。

下面就可以使用第 11 和 12 帖的方法来测量荧光强度了。甚至方法还简单一些：在选色时，只需调整背景强度就行了。先测量一下没有荧光部分的灰度，比如测得背景值是 240，那就在光密度校正中选择 240 作为背景，在 HSI 选色中只需考虑强度而不必考虑色彩，选择 H：0-255、S：0-255、I：0-240。

如果阴性样品的荧光非常弱，常常会导致测量错误：图片上大量没有荧光的样品区域未被计入 area 之中，导致阴性样品的测量值偏高。此时需手动选择样品区域，然后测量这个区域的 IOD 与 area，这样最后计算出来的 mean density 将是一个很小的数。

下面作个实例：这三张照片，左边一张背景偏绿，中间一张曝光适当，右边一张则是曝光过度了。

荧光照片上经常会有一些明亮的杂技点，这对于荧光强度的测量具有极大的干扰，它们必须被除掉。除去它们的方法很多。可以自己想办法。这里使用选色的办法。在选色窗口里要使用 black on transparant 显示方法，选择上那些亮斑点后就自然给填上黑色了，然后点 creat preview imge 按纽把图片照下来。

转成灰度图片。

还要作个黑白反相 Invert contrast 。反相后一定要再点一下 apply contrast。补充：其实那个菜单最下面的 invert image 就是直接反相图片的。点那个就行了。

先作光密度较正，如果荧光照片的背景纯黑，0-255 就行。然后选择 cont/size 的测量参数：测量 IOD 与 area。

这张照片的细胞照得挺大，可以把 area 的过滤值选大一点，filter start 为 500，这样就有效排除掉了哪些另外，还要在 cont/size 的 option 中把 fill holes 选择给勾上。

小的杂质点。

对于灰度图片，选色窗口里只有强度一项选择，0-250 就行了。当然，这个值要根据自己照片的情况来定，原则应是选择上所有的细胞。

点 count 进行测量，然后从 view statistics 窗口中读取 IOD SUM 及 area SUM 的数据。 mean density =（IOD SUM）/(area sum) 这就是这张照片上细胞的平均荧光强度值。

要保存 count/size 及 segmentation 两个窗口的 setting file。在测量其他照片时，直接调用这两个设定文件而不必再次去调整那些测量参数。

这个值很正常。从白到黑的光密度范围在 0-2 之间（指数光密度曲线），一般免疫组化照片的平均值为 0.1，0.5 的就已经很深了。这张荧光照片本身就很浅，0.035 这个值挺合理的。那此得到几十上百的是使用的线性光密度曲线，范围在 0-255。荧光强度也是符合朗伯-比尔定律的，所以要使用指数光密度曲线。测量值更准确一点。使用线性曲线也可以，误差大一点。

下面这张图测量参数为：背景校正：5-255 强度分割阈值为 20-255 面积过滤范围下限为 100 象素。

测量值为 mean density=1679162/51708=32.5

注意此时并不需要对图象进行反相。对荧光照片，如果用线性光密度校正，正好是黑的为 0，白的为 255。前面使用标准的指数光密度校正时，是白的为 0，黑的为 2.0。所以荧光图象要反相。

十四、双染料染色照片的合成方法 1.先调整图像对比及亮度。

2.分别转换成灰度图片

3.对其中一张进行 co-localization 操作，注意别把红绿色给弄反了。

再作一遍。这回用 color composite 工具作，两种方法都是可以的。

似乎使用液晶显示器与 CRT 显示器的色彩有很大不同。作图像处理分析的时候当使用 CRT 显示器，色彩更好一些。有人对我说过，搞图像的电脑要使用 CRT 显示器。

现在是使用 CRT 显示器制作的效果。

附录：

Imagepro plus 应用实例 1－Western Blot 照片的密度分析。

另有一个 gel-pro 软件是专门用来分析电泳图片与 WB 图片的，虽然用 IPP 也能分析这些图片，但精度及

方便程度都不及 gelpro。

如果手头没有电泳分析软件，拿 IPP 来勉强测量一下也可以。

在分析这类照片时，IPP 最弱的地方就是扣背景的能力不如 gelpro。

简单地分析操作只需要用 irregular 工具，然后 convert AOI to object 就行了。但对于背景不好的图片来

说，这样分析的误差大得离谱。

下面这张图片的背景不均匀，这在 WB 图片中是相当常见的。

再测量一次，数据就不同了，这是背景对条带亮度的干扰。

所以扣除背景是非常重要的一环。所有专门分析电泳图片的软件都有扣除背景这个功能。

Imagepro plus 应用实例 2－细胞计数。前面所述为最基本的程序操作技术。在实际的分析测量中，需要灵活应用这些技术来处理。

在实际的应用中，需要从样品制备，拍摄照片处理照片到最终分析测量全面考虑，才会有满意的效果。所以对于从现在开始的每一个测量示例，都要从样品处理，或者照片拍摄开始讲起的。

面对照片上密密麻麻的细胞，用图片分析的方法来数细胞个数是很有好处的。

要想数照片上有多少细胞，首先是要告诉程序，那些是细胞。作法就是要选择照片上的细胞。然后数个数。作计数的时候，照片上的细胞必须是分开的，不能联在一起。如果照片上的细胞一个个都挨在一起，就没法数清楚了。

计数是ｃｏｕｎｔ／ｓｉｚｅ工具的基本用途。

这是比较理想的可用于计数的照片。图上细胞核被染上的明显的蓝色。这样测量起来是相当容易的。只要选上

细胞的颜色就能准确测量了。

选色时范围太大会使挨得近的细胞联到一起，所以需要仔细调整选色范围。这里选择的是 H：４４-２５５，Ｉ：２-１３０，Ｓ：０－２５５。

选择好细胞核后，要考虑图片上小杂质点的影响，因此根据细胞的大小，对面积测量值设定了一个过滤值： start:200,end:20000.（见上图）

无论怎么仔细，最终测量时还是会有少量细胞核联到一起了，需要把它们分开。点 edit。下面有好几个带 split 的子菜单，第一个是手工分割。点选之后，到图片上两个相连的细胞之间划一道分割线，点右键，就能把它们分开。还可以用 auto split 或者 watershed split 来自动分割。但自动分割往往会剩下一两个漏网之鱼的。一般情况下，可以忽略之。毕竟用自动分割速度快，方便。几百个细胞核计数有一两个的误差还是很小的。

为了看清楚相连的细胞是否分开了，可以点 option,设置显示方式为 outline.看得清楚。

计数结果可以打开 view 里的那些子菜单项上看。其实在 count/size 窗口上就有。下面的两行分别是： total count:469, in range:378

意思是，一共测到了 469 个对象，在过滤范围内的有 378 个。

所以最终的测量值是 378.

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