维普资讯 http://www.cqvip.com 科 学 前 沿 陈大元 【作者简介】陈大元 核的相互作用可能对核产生某种影响。就克 （合子）结扎，核限制在其中一半胞质内，另 江苏吴县人，１ ９５５年生， １ ９５７年毕业于山东大学 生物系胚胎学专业，师 隆动物的主要性状来说是由核决定的，卵浆 半个胞质核缺失，含核的这半个合子可以分 可能也起部分作用。所以说克隆是复制，但 裂。几次分裂后，结扎处松动，核可以通过 就应该强调的是克隆不等于完全复制。后天 细胞质桥进入无核的另一半胞质中，于是这 的获得如知识，技术和记忆是不能复制的。 哺乳动物的克隆可通过两条途径实现， 一从童第周教授和张政一 教授，现为中国科学院 动物研究所生物学国家 重点实验室首席研究员， 部分胞质恢复分裂和发育，最后产生了两个 小个体的双胞胎。根据这一实验Ｓ￣）ｅｍａｎｎ推 核）放八去除遗传物质的合子，藉此来研究 是应用胚胎细胞分离和分割技术，即在８细 测可通过较高发育阶段的核（即分化细胞的 胞之前每个细胞均可发育成一个个体，从２细 ｆ币和受精生物学学科带头人，１ ９８４ 胞至囊胚的早期胚胎也可以把它切成两半或 遗传物质在细胞分化中的作用以及在发育和 ０ＷＡ大学医学院回国后，长期从事 两半以上产生两个或两个以上的个体；另一 分化过程中基因所包含的信息是否丢失或失 条途径是通过细胞核移植构建新的重构胚或 活，这就是核移植理论的诞生。１ ９５２年美国 重建胚。目前所说的动物克隆多是指后一种， 费城癌研究所的科学家Ｒｏｂｅｒｔ Ｂｒｉｇｇｓ和 即通过核移植生产克隆后代。 Ｔｈｏｍａｓ Ｊ．Ｋｉｎｇ将蛙囊胚的细胞核移植到 去核的卵母细胞质内，发育成为 蚪。 Ｂｒｉｇｇｓ和Ｋｉｎｇ所采用的去核方法效率超过 显微受精和动物克隆研究。现为 郎“克隆大熊猫研究”攀登专项的 家、中国科学院“异种克隆大熊猫 创新工程重大项目的课题主持人 “异种克隆中线枉体命运研究”课 。动物克隆的历史 国务院特殊津贴获得者。 动物克隆的发展史可分为三个阶段，印 ９Ｏ％，他们的核移植实验结果显示，重构胚 同种胚胎克隆、同种体细胞克隆和异种体细 可以卵裂发育成 蚪，后来他们还证明 蚪 年２月，ｗｉｌｍｕｔ等正式向外界报道 胞克隆等三个阶段。细胞核是细胞的“司令 经过变态成为幼蛙。 也用来自６岁绵羊的乳腺上皮细胞 部”，它对细胞发出指令，直接调控细胞的生 Ｂｒｉｇｇｓ和Ｋｉｎｇ的工作开启了动物克隆 “多莉”羊。一石激起千层浪，这 长、发育直至凋亡。核中的ＤＮＡ是遗传信息 的第一次浪潮。美国、英国、中国、法国和日 左“妈妈”身边吃奶的ｄ＼羊立刻成 的载体，是细胞的中枢。细胞核埋没于细胞 本的科学家很快进入这一领域。１ ９６２－６５年， 主目的焦点。“克隆”这个过去只属 质中，而细胞质含有内质网、核糖体、高尔 Ｍｃｋｉｎｎｅｌｌ，Ｋｉｎｇ￣ＤＤｉ Ｂｅｒａｒｄｉｎｏ将成年蛙肾 冢的词汇也摇身～变，成为人们在 基体、线粒体等细胞器。２Ｏ世纪以来，人们 肿瘤细胞注入去核的卵细胞获得可游动的 茶余饭后的谈料。那／厶“克隆”究 直设想将细胞核进行移植，到２Ｏ世纪中叶 蚪，１９６６年Ｇｕｒｄｏｎ和Ｖ．Ｖｅｈｌｉｎｇｅｒ将 蚪 ．７克隆一词来源于英文“Ｃｌｏｎｅ”的 科学家们终于在克隆技术（核移植技术）研 肠细胞核作供体成功地获得成年蛙。７Ｏ年代， 丈《郎曼词典》上的定义为：通过 究中取得了突破性的进展，从而使得克隆羊 科学家应用核移植技术以高度分化的蛙皮肤 扫单个细胞产生的和亲代在遗传上 “多莉”得以诞生。 细胞。但是现在动物克隆是用核 最早提出“核移植”克隆方法的人是德 细胞和淋巴细胞作供体获得了 蚪。 将细胞核移植技术首先应用于鱼类研究 去来克隆，就核而言是复制，但它 国的胚胎学家、诺贝尔奖获得者Ｈ ａ ｎ ｓ 的是我国的童第周教授，在他及其学生们几 受体的卵质和供体的胞质，他们与 ＳＤｅｍａｎｎ，他用婴儿的头发将蝾螈的受精卵 十年的努力下，已取得了举世注目的成就，在 中国人２００２年第９期 维普资讯 http://www.cqvip.com 科 学 前 沿 国际上处于遥遥领先的地位。 组在２一细胞阶段，甚至在合子阶段的后期就 多动物例如：狗，马以及各种濒危动物进行 哺乳动物胚胎细胞克隆 ８Ｏ年代，小鼠胚胎细胞克隆掀起了动物 开始表达，留给移八核重新程序化的时间很 了相当部分的试验，可是最后的结果却并不 短有关。 理想。应该认为只要充分了解一种动物生理 ２００２年初，Ｈｏｃｈｅｄｌｉｎｇｅｒ用完全分化的 克隆的第二次浪潮——核移植技术开始应用 于哺乳动物。１９８１—１９８２年，瑞士日内瓦大 学和美国杰克逊研究所合作交替以第一作者 身份在Ｃｅ¨和ＰＮＡＳ上发表克隆小鼠的论 文。他们把小鼠ＩＣＭ细胞直接注入合子后，再 特点并采取相应的核移植措施后，所有的动 Ｔ、Ｂ淋巴细胞作为供核移八去核的小鼠卵母 物有可能均可以被克隆出来。细胞后发育到囊胚，然后将其内细胞团培养成 ＥＳ细胞，然后将ＥＳ细胞注入四倍体囊胚腔 中获得了来源于Ｔ、Ｂ淋巴细胞的克隆小鼠。 哺乳动物异种细胞克隆 １ ９９９年我们科研小组将成年大熊猫体细 从某种意义上解决了克隆动物是体细胞重编程 胞作为供核细胞移植到去核的兔卵母细胞中 去除合子核，生出了３Ｒ克隆小鼠，但这一实 构建异种重构胚，体外培养获得孵化囊胚。 还是夹杂在体细胞内的干细胞来的争论。 验未能被其他实验室重复出来。ＴＳＵｎｏｄａ “多莉”羊体细胞核移植技术建立后，很 ＤＮＡ检测表明重构囊胚细胞核来自大熊猫，（１ ９８７）将小鼠胚胎８细胞期的核移：￣ｌＪ２细胞期 快就被扩展到农业上以及在未来人类医药生 细胞质中含有大熊猫的线粒体。从而掀开了 的去核的胞质中，生出了移核小鼠。Ｌｉ Ｍｅｎｇ 产方面将起着重要作用的动物一一牛上。 动物克隆的第四次浪潮。与Ｍａｒｋｅｒｔ又将小鼠胚胎４细胞的核移到２ 体细胞克隆已在绵羊、小鼠、牛、猪、兔、 １ ９９８年“Ｓｃｉｅｎｃｅ”杂志报道了美国科学家 细胞期的去核胞质中，也生出了移核小鼠。 用培养的携带外源基因的胎牛成纤维细胞作 猫上获得成功，这些都属于同种克隆，即供 １ ９８６年，英国Ｗｉｌｌａｄｓｅｎ将电融合技术引入 为供核获得４头转基因克隆牛。７个月后， 体细胞和受体卵母细胞来源于同一种动物。到核移植中，这种方法比传统的病毒或化学 “Ｓｃｉｅｎｃｅ”再次报道日本科学家以完全分化 但对于濒危动物而言，同种克隆并不现实。例 介导法更方便、安全。他把绵羊的８细胞胚胎 的牛卵丘细胞和输卵管上皮细胞为核供体的 如，大熊猫现存数量已不足１０００只，很难获 作供体进行核移植，获得发育到期的克隆羊， 成功地克隆了牛。随后，体细胞克隆牛在新 得受体卵母细胞，因此有必要开展异种克隆 年后，美国Ｊｉｍ Ｍ Ｒｏｌｄ等用类似的方法 西兰、法国、德国等国家也获得成功。中国 技术研究。异种克隆就是将一种动物细胞核 获得胚胎细胞克隆牛，此后胚胎细胞克隆动 首批成年体细胞克隆牛出生于２００２年１月， 移植到另一种动物去核卵母细胞中。异种克 物，如山羊、猪、兔、大鼠等纷纷降生。 以牛耳壳皮肤成纤维细胞克隆出高产奶牛和 隆探索涉及许多基础研究，如异种核质的相 ９Ｏ年代是我国科学家利用胚胎细胞进行 优质肉用黄牛。在技术上采用将受体卵母细 互作用、细胞核和线粒体的相互关系、体细 动物克隆的鼎盛时期，西北农业大学、中国 胞去核时间提前、采用细胞松驰素Ｄ和放线 胞能否在异种卵胞质中去分化并支持早期发 科学院发育研究所、中国农科院、江办省农 菌酮联合使用等一系列配套措施后获得了１ ４ 育、发育早期的重构胚能否着床并进行全程 科院、广西农业大学和湖南医科大学等科研 发育等问题。异种克隆可以为生殖、发育、免 头克隆牛犊，有５头存活至今。 单位的科研工作者相继克隆出了牛、羊、猪、 山羊，特别是奶山羊，是开展生物反应 疫和信号传导等领域的相关研究提供很好的 兔及小鼠等几种克隆动物。 器研究常用的一种动物，因此体细胞克隆山 实验基础。本实验室现阶段研究表明大熊 １ ９９７年，在美国的中国学者Ｌｉ Ｍｅｎｇ以 羊的研究也倍受注目。１９９９年美国研究人员 猫一兔的异种重构胚可进行早期发育并可以 ８细胞期的胚胎做供体成功地克隆出２只猴， Ｌ． 用携带外源基因的山羊胎儿成纤维细胞作为 在异种动物——猫子宫着床。美国Ｎｅａｌ这是灵长类首次被克隆。 ｒｓｔ领导和科研小组将分别来自牛、绵羊、 供核获得３只克隆山羊。国内由扬州大学和中 Ｆｉ哺乳动物的体细胞克隆 科院发育所合作，１ ９９９年用胎儿成纤维细胞 猪、猕猴和大鼠皮肤成纤维细胞用作供核细 １９９７年，Ｎａｔｕｒｅ发表Ｗｉｌｍｕｔ等人的克 作为供核成功地克隆了山羊。２００２年西北农 胞，移植到牛去核卵母细胞中。除了大鼠体细 胞重构胚停止于２一细胞期外，其他异种重构 隆羊论文，来自６岁成年羊的乳腺上皮细胞移 业大学用成年动物的体细胞克隆出山羊。 成年体细胞克隆猪出生于２ ０ ０ ０年， 胚均能发育，到达囊胚期的时间与各物种正 ｅｊａｅｖａ等首先将培养的颗粒细胞放八去核 常的胚胎发育进程相当。２０００年，美国ＡＣＴ 克隆羊“多莉”。该项工作掀起了动物克隆的 Ｐｏｌ第三次浪潮。小多莉出生于１ ９９６年５月，它 卵母细胞的卵周隙，电融合发育到类合子期， 公司利用异种核移植的方法克隆了一种濒危 植到去核卵母细胞中，重构胚发育最终生出 的名子取自一位西部乡村歌星一一多莉’帕 再将重构胚的类合子核移八到正常受精的去原 的野黄牛胚胎，这种牛的染色体数目是５８条， 顿，也许是因为他的父亲“Ｗｉｌｍｕｔ”博士喜 核合子的卵周隙，电融合后立即移植到同期发 而用为受体的牛 口母细胞的染色体数目是５４ 欢这位歌手吧，不过多莉羊恐怕生来就注定 情的受体母猪卵管，７２枚重构胚经移植后得 条。２００１年他们获得了一头克隆牛“Ｎｏａｈ”ｅｎｃｅ”和 虽然它在出生后两天死亡，但这一结果表明 要比歌星多莉赢得更多的关注和喝彩，从它 到５只克隆小猪。之后在“ＳＣｉ出生的那一刻起，关于它的种种质疑和争论 “Ｎａｔｕｒｅ Ｂｌ０ｔｅｃｎ０１０ｇｙ”先后又有数篇克 就未平息过。“多莉”的消息一传出，克隆的 隆猪的报道。２００２年２月由中国学者赖良学 消息便如雨后春笋般从世界的各个角落里冒 等做成了被敲除０【～１，３一半乳糖苷转移酶基 了出来。 因的克隆猪出生。２００１年１２月２２日，第一 ２００２年４月，Ｃｈｅｓｎｅ等在考虑到兔胚 １ ９９８年，美国夏威夷大学等率先在小鼠 只克隆猫ＣＣ出生。 上进行了成年体细胞的克隆。２０００年，研究 人员采用电融合的方法成功的克隆了小鼠。 胎发育过程中快速的细胞周期动态规律以及 虽然体细胞克隆小鼠已经获得成功，但到目 受体子宫短暂的着床窗口期的特点后，调整 前为止仅有为数不多的几家实验室能重复出 克隆程序，成功地获得体细胞克隆兔。 来。究其原因，一方面与卵胞质膜较脆体积 虽然体细胞核移植技术取得了相当大的 较小有关，另一方面可能与小鼠胚胎的基因 进展，但被克隆出来的动物毕竟是少数，许 ２００２年第９期科学中国人１７ 维普资讯 http://www.cqvip.com 科 学 前 沿 并完成全程发育。Ｌｏｉ Ｐａｓｑｕａｌｉｎｏ等将欧 的超急性排斥。除此之外，要实现高产的生物 短缺，更不会有其他化疗引起的毒副作用，而 洲盘羊的颗粒注八绵羊的去核卵母细胞中， 反应器，转基因必须与克隆技术互作。 能使病人得到彻底的治疗，所以治疗性克隆 重构胚发育到囊胚时移八受体绵羊子宫角， 盘羊。所有这些结果表明，用异种核移植的 方法延缓濒危物种的灭绝是可行的。 三、生产药用蛋白的生物反应器的克 将使临床医学发生革命性的变革。 现在人的胚胎干细胞系已经建成。现在 有２只妊娠，其中１只产下了１只正常的欧洲 隆和扩 自从１ ９８１年第一只转基因鼠出生后，人 全世界已有十几个实验室建成了几十个人胚 们就已经想到利用动物作为发酵罐来生产外 胎干细胞系。这表明人类胚胎干细胞分离技 源医用蛋白，１ ９８７年在小鼠乳汁中获得了绵 术已经日趋成熟。大量动物实验以及胚胎干 羊的ｐ一乳球蛋白和人体的组织型溶纤酶原 细胞的定向诱导和组织工程都以开展，可望 动物克隆的展望与应用前景 动物克隆技术是生命科学不断发展的产 激活剂，这是第一次实现了乳腺反应器生产 不久的将来治疗性克隆将会全面开花。 物，反过来，克隆技术的产生又推动了整个 药用蛋白的梦想，这一梦想将目的基因置于 五、加速畜牧业育种，快速繁殖 生命科学的发展。动物克隆研究是要解决克 某个在乳腺特异表达的启动子控制之下，该 用传统的选育方法一个优良个体要几十 隆中存在的难题，寻找切八点，推动相应基 启动子就引导和促使目的基因在乳腺组织中 年，用体细胞核移植技术可在短时间内获得 础科研的工作，二是拓宽克隆技术的应用范 表达，乳汁中就含有目的基因的产物，人们 个优良个体的大量复制，并可免去后裔测 一畴，推动人类历史的发展。 一只要将乳汁与基因产物分开就可以得到医用 定。用体细胞核移植技术还可以产生特定性 大的发酵罐旋转，这里不需要高大的厂房与 鉴定更方便、准确。 、、蔸隆技术可以大夫提高转基因的 蛋白。这里既不需要车轮滚滚，也不需要庞 别的后代，比人工选择后代性别或胚胎性别 延缓濒危物种的灭绝 效率 生产转基因动物的常规方法有二：１、原 车间，也不需要无数精密仪器和无数的工人 核注射法，外源基因随机整合。整合率通常 组成的流水线。这里只需要一头首代高产转 据世界物种保护委员会２０００年公布的数 为５—１ Ｏ％；２、培养的体细胞通过钙沉淀或 基因奶牛（或转基因细胞）和一两台显微操 据，全世界共有５４８５种动物面临灭绝，其中 脂质体介导神合随机转染，经选择，检测。把 作仪就可以通过高表达的转基因牛体细胞 １ ８Ｏ种为哺乳动物。如何拯救这些物种，除了 转基因的细胞选择出来，再用核移植的方法 （或转基因细胞）的克隆扩大种群来提高产 列其栖息地进行保护外，随着“多莉”的诞 将转基因技术与核移植技术相结合将大大提 量，扩大牛栏和牧场就能扩大生产规模。在 生，利用核移植技术延缓这些动物的灭绝成 高转基因的效率。Ｓｃｈｎｉｅｋｅ等于１ ９９７年比 这里整个药用蛋白生产都在奶牛体内进行， 为可能。美国ＡＣＴ公司的“Ｎｏａｈ”的出生， 较了原核注射法与转基因细胞核移植法的转 动物自身复杂的蛋白表达系统和修饰系统保 欧洲盘羊的成功克隆结合我们研究小组的工 基因效率，用原核注射法产生一头转基因绵 证产物具有高的生物活＇ｔｉＥ。这里的主要工作 作，认为利用克隆技术延缓濒危动物的灭绝 羊平均需要绵羊５１．４头，而用核移植方法只 是收获和分离，这将大大降低生产成本而造 完全是可行的，同时也是非常重要的。 需要２０．８头。 福于人类 七、宠物的克隆 ：： 、克隆与转琏闲技术互怍才能实现 动物遗传的改造 体细胞通过同源重组技术可在选定的基 体细胞克隆的成功，立即引起许多公司 列这一技术的关注，因为这一技术在克隆宠 物方面具有巨大的潜在市场。美国遗传保存 和克隆公司正在从事这方面的开发，他们为 愿意克隆宠物的人提供冷冻保存宠物的组织 服务，在他们提出这一计划当日就接到成千 上万的电话。同样美国ＡＣＴ公司２００２年２ 月１ ５日在其网站上打出报告愿为宠物保存细 因组区域精确引进一个外源基因，不仅能为 转基因实现最佳表达（时间，空间，数量乃至 质量）选择合适的插八位点，而且能列特定区 域进行打靶，还可以对基因进行修饰。基因打 靶通常是隐性的（如基因剔除）或是共显性的 （如基因修饰）。要看到表型效应，通常需要产 生双等位基因突变，也就是说需要经过多重 遗传改造，在目前还没有家畜胚胎干细胞的 情况下，仅仅用体细胞是很难实现的，必须依 赖克隆技术与转基因技术互作，就像我国旅 美学者赖良学２００２年所作的，敲除Ｏ【一１，３一 卵管２Ｏ天，预计着床８天发育的胚胎。５和 ５为大熊猫的胚胎 胞，２００２年２月２２日Ｎａｔｕｒｅ报道第一只体 细胞克隆猫成功。狗是人类喜爱的宠物之一， 列狗的克隆也成为不少人的希望，早在１ ９９８ 年一位百万富翁向美国得克萨斯ＡＭ大学科 学家提供２ ３ ０万美元用于克隆他的宠物 Ｍｉｓｓｙ，但由于狗繁殖方面的一些特殊特征 至今克隆狗仍未诞生。 八、蔸隆遗传背景宠 一致的实验动物 用于实验的动物要求遗传背景尽可能一 半乳糖苷转移酶基因的克隆猪那样。由于他 所用的猪的胚胎细胞是体细胞不是永生的细 阿、 吖性－克＝隆 治疗性克隆是指从病人的身体取部分体 胞，是有一定寿命的，只能进行一次敲除实 细胞，将它们移八核卵母细胞，供体细胞核在 验，另一等位基因的敲除必须等待敲除基因 卵胞质中去分化，开始胚胎发育，发育至囊胚 致，尤其做药物实验要求更高，故以往的实 细胞的克隆，所产生的克隆胚胎细胞的培养， 分离出内细胞团培养得到病人的胚胎干细胞， 验动物常用近交系，这些动物的遗传背景已 然后进行另一等位基因的敲除，才能实现猪 体外定向诱导分化为病人需要的细胞，取代 经很接近，但若能用克隆动物，遗传背景完 的体细胞的遗传改造。然后再将已敲除 病人已失去功能的细胞或组织如分化为可分 全一致，那／厶就可以大大减少动物的数量和 １，３一半乳糖苷转移酶双等位基因的猪体 泌胰岛素的胰腺细胞来治疗糖尿病；分化为 实验次数，结果将更可靠。 作为生命科学ＯＢ０￣２１世纪科技之门的扣 细胞进《亍核移植产生ａ一１，３一半乳糖苷转酶 分泌多巴胺的神经细胞治疗帕金森氏症。由 基因缺失的克隆猪。这种猪的细胞和组织或 于这种细胞在遗传上与病人完全一样，故移 门石——克隆技术，有着极其厂泛的研究空 器官移植到人体就不会引起人类对该移植物 植后不会引起免疫排斥，也不会存在原材料 间，克隆技术的最终掌握必将造福于人类ｊ■ ｌ８科学中国人２００２年第９期