竹黄菌丝体中竹红菌甲素的提取工艺

JournalofGuizhouUniversity(NaturalSciences)Vo.l27No.6

Dec.2010

文章编号󰀁1000-5269(2010)06-0070-04

竹黄菌丝体中竹红菌甲素的提取工艺

杜󰀁文,孙春龙,韩燕峰,梁建东,董󰀁旋,梁宗琦,郁建平,郭丽丽,张红涛

(1.贵州大学生命科学学院真菌资源研究所,贵州贵阳550025;2.贵州大学农业生物工程省重点实验室教育部绿色农药

与农业生物工程重点实验室,贵州贵阳550025;3.贵州大学贵州省生化工程中心,贵州贵阳550025;

4.山东省临沂市兰山区农业局,山东临沂276000;5.青岛市市立医院,山东青岛266011)

1,2

3

1*

1

1

1

2

4

5

摘󰀁要:采用浸提法对竹黄菌液体发酵竹红菌甲素的提取工艺进行优化,以竹红菌甲素得率为评

价指标,选用单因素实验和正交试验,考察有机溶剂、粉碎与否、提取物干燥温度、浸提温度、有机溶剂的量、浸提时间等因素对竹黄菌丝体竹红菌甲素得率的影响。实验结果表明:对3.0g的菌丝体采用35󰀁干燥温度,粉碎后加入无水乙醇的量为40mL,浸提温度为30󰀁,浸提时间24h,可以获得最佳的竹红菌甲素浸提效果。关键词:竹黄菌;竹红菌甲素;提取工艺中图分类号:R284.2󰀁󰀁文献标识码:A󰀁󰀁竹黄ShiraiabambusicolaHenn.是一种寄生在竹子嫩枝上的真菌,它主要分布在我国南方各省,在日本也有相关报道。竹黄的主要成分之一是竹红菌甲素,它是一种苝醌类光动力学色素,也是一类新型的光化学疗法药物,经药理实验与临床应用。显示了较强的生理活性和药理作用。其主要药理作用有镇痛、抗炎、抗菌、抗癌、护肝和保护心血管等。竹红菌甲素的含量是衡量竹黄品质的重要指标。竹红菌甲素在不同pH值下,呈不同的颜色,其最大吸光度和相应波长较稳定。竹红菌甲

[3]

素的耐光性较好,对温度的不同变化亦较稳定。本实验将利用竹红菌甲素的这些特性来分离提取。

竹红菌甲素可以采用发酵法生产,而发酵的产物提取是生产过程中很重要的一个环节,有时提取产物的部分占到生产成本的一半以上。由资料可知,乙醇和丙酮都是优良的竹红菌甲素溶剂

[4-6]

[1,2]

型菌株的选育和液体发酵竹红菌甲素的后续处理等研究工作奠定基础。

1󰀁材料

1.1󰀁主要实验仪器:紫外分光光度计(752型上海第三分析仪器厂)。

1.2󰀁主要试剂:无水乙醇、葡萄糖、竹红菌甲素(纯度98%)、蛋白胨、丙酮以上试剂均为国产分析纯。

1.3󰀁试验用菌株:用于本实验的全部菌株,皆分离于采自浙江省桐庐县地区的竹黄S.bambusicola标本。有性型鉴定和无性型菌株的分离、鉴定按作者的方法进行

[8]

。标本和菌株皆保存于贵州大学真

菌资源研究所。

1.4󰀁培养基:PDA培养基和查氏培养基均按常规进行配制

[9]

。

。

在实验过程中,选择一套省时省力经济的产物提取方法在微生物发酵的整个过程中也相当重要。很

少有人研究竹黄菌发酵产生竹红菌甲素含量的测定方法,仅有张灏

[7]

2󰀁方法

2.1󰀁竹红菌甲素的提取

竹黄菌菌丝体采用深层发酵培养。250mL的培养容器(三角瓶)中加入50mL培养液。培养条件:PDA培养基,温度26󰀁,摇瓶转速为120r/min.接入直径8mm的菌饼,连续摇瓶7天,待发酵液中充满灰白色的密集粘滑的菌丝球时终止发

报道了有关丙酮提取竹红菌

甲素的工艺。本文主要根据竹红菌甲素的性质、稳

定性方面的报道,研究了液体发酵产生的竹红菌甲素的最佳提取液乙醇的提取测定方法,为竹黄无性

󰀁收稿日期:2010-06-21

基金项目:贵州省自然科学基金项目[黔科合J字(2008)2266号];贵州大学引进人才科研项目[贵大人基合字(2007)035号];贵州大学

生命科学学院研究生创新基金项目[SKY200701]

作者简介:杜󰀁文(1981-),女,山东临沂人,博士研究生,研究方向:药用真菌,Emai:lduwen6688@163.com.*通讯作者:韩燕峰,Emai:lswallow1128@126.com.第6期杜󰀁文等:竹黄菌丝体中竹红菌甲素的提取工艺

󰀁71󰀁

酵。将发酵菌液过滤并用蒸馏水洗涤三次后,将得到的菌丝体低温烘干后,用无水乙醇对其进行萃取。

2.2󰀁紫外分光光度法测定竹红菌甲素的含量2.2.1󰀁确定有机溶剂

将0.1g子实体干品进入25mL乙醇或是丙酮中,分别在380-630nm波长下测定吸光度,以获得竹红菌甲素的最佳溶剂,并确定测定波长。2.2.2󰀁粉碎对竹红菌甲素提取的影响

取竹黄菌发酵产生的干菌丝体和菌丝体粉末,分别浸入40ml无水乙醇中,30󰀁浸提时间24h,在465nm波长下测定吸光度。通过吸光度确定菌丝体是否需要粉碎。

2.2.3󰀁竹红菌甲素提取工艺条件的确定

用发酵菌丝球产生的竹红菌甲素,根据单因素实验结果,以无水乙醇溶液为浸提溶剂,选取浸提温度、培养物干燥温度、液料比和浸提时间为变量,竹红菌甲素的含量为对应值,采用正交实验,在四因素三水平上对浸提条件进行优化,各因素水平见表1.

表1󰀁提取竹红菌甲素工艺条件的因素和水平因素

提取物干燥温度(A)浸提温度(B)

加入有机溶剂的量(C)浸提时间(D)

水平󰀁25󰀁20󰀁20mL12h

水平󰀁35󰀁30󰀁40mL24h

水平󰀁45󰀁40󰀁60mL36h

竹红菌甲素在波长465nm处有最大吸收峰,所以确定465nm为竹红菌甲素含量的测定波长。而且作为竹红菌甲素溶剂,乙醇具有与丙酮基本等同的效果,且无水乙醇的效果比丙酮略好,因此选择更加廉价的乙醇作为竹红菌甲素的溶剂。3.2󰀁粉碎对竹红菌甲素提取的影响

对竹黄菌发酵干菌丝体直接提取时的OD值为0.53󰀁0.02,对竹黄菌发酵菌丝体粉碎后,提取的OD值为0.63󰀁0.03,所以作者选择对发酵产生的菌丝体进行粉碎。

3.3󰀁乙醇提取竹红菌甲素的正交优化结果

取一定量的发酵液产生的菌丝培养物,选择不同的干燥温度,菌丝提取物干燥到相同水分含量,考察不同干燥温度对竹红菌甲素含量的影响,再分别取3󰀁0g菌丝培养物,以乙醇为浸提溶剂,选取浸提温度、浸提时间、料液比和培养物干燥温度为变化量,以提取物竹红菌甲素在可见光区域的465nm波长处的OD值为对应,采用正交试验进行L9(3)正交试验,正交试验结果见表2.

表2󰀁提取竹红菌甲素工艺条件的正交实验结果试验号1

23456789K1K2K3R

A111222333573623613050

B123123123537653620116

C123231312573630607057

D123312231577633600056

吸光度(󰀁=465nm)

0.0.0.0.0.0.0.0.0.456859586564586363

4

3󰀁结果

3.1󰀁有机溶剂对提取物的影响

据文献资料的报道,丙酮或是乙醇提取竹红菌甲素的提取率比较高,所以本实验选取丙酮和乙醇。取0.1g子实体分别与25mL的丙酮和乙醇溶剂混合。使用紫外分光光度计测量结果如图1所示。

0.0.0.0.0.0.0.0.0.

0.0.0.0.

0.0.0.

󰀁󰀁有极差分析可知,各因素对提取竹红菌甲素的量都有影响,影响的大小顺序为B>C>D>A.影响乙醇进提法提取竹黄菌丝体竹红菌甲素的各因素中,B(浸提温度)相对于其他因素,对竹红菌甲素的提取影响较为显著。

按照方差理论进行方差分析,得方差分析结果,见表3.各因素最佳理论组合方案为A2B2C2D2.为了节省生产成本和节约时间,对3.0g的原料采用35󰀁干燥温度,粉碎后加入无水乙醇

图1󰀁乙醇和丙酮溶剂中的可见吸收光谱

的量为40mL,浸提温度为30󰀁,浸提时间24h,可以获得最佳的浸提效果。󰀁72󰀁

贵州大学学报(自然科学版)第27卷

表3󰀁提取竹红菌甲素工艺条件的方差分析方差偏差平

自由度

来源方和

均方

F比444444556556)

表4󰀁最佳工艺试验

试验号123

浸提温度30󰀁30󰀁30󰀁

浸提时间24h24h24h

液料比(g/mL)

3󰀁403󰀁403󰀁40

提取物干燥温度

35󰀁35󰀁35󰀁

有机溶剂乙醇乙醇乙醇

粉碎与否粉碎粉碎粉碎

吸光度0.750.750.76

F临界值4.4.4.4.460460460460

3.4󰀁最佳工艺验证试验

根据正交试验分析结果,按最佳理论方案进行验证试验,结果见表4.

如表4可知,该工艺的重复良好,竹红菌甲素得率较稳定,可以指导实际中的提取工作。

A0.00423.283E-030.B0.02224.685E-032.C0.00523.242E-030.D0.00522.433E-030.误差0.048

RSquared=1.000(AdjustedRSquared=.

4󰀁讨论

近年来,随着对竹红菌甲素药用价值研究的深入,竹红菌素是一种新型的光疗光敏剂,是目前已知的在可见光区内优良的光敏剂。这类化合物可经过普通生物合成途径产生,它们的结构具有立体化学的特征,表现出光动力学活性,具有显著的光疗作用,它的光敏化作用可引起细胞膜蛋白交联、膜脂过氧化、膜流动性改变,诱导细胞内的生物大分子(DNA、蛋白质、脂类等)损伤和引起酶的失活,并导致细胞骨架的损伤,使细胞周期部分阻断于S期,因而对细胞具有明显的杀伤作用。临床上已用来治疗皮肤病,如外阴白色病变和软化疤痕疙瘩。近年来,研究发现它具有优良的光敏杀伤肿瘤细胞和抑制艾滋病病毒HIV󰀁I的作用,并且可作为新型的光活化农药和潜在的光电转换材料。随着市场对竹红菌甲素的需求日益增加,对其提取工艺的改良优化,使其适应大规模工业生产需求也就迫在眉睫。本实验采用更加廉价易得的无水乙醇作为竹红菌甲素的提取液,是的生产成本大大降低,对提取工艺进行正交试验优化后,减少了乙醇用量,缩短了时间,降低了提取成本,提高了工作效率。该工艺为以后大规模工业生产竹红菌甲素奠定基础,有利于竹红菌甲素的开发利用。

[10]

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第6期杜󰀁文等:竹黄菌丝体中竹红菌甲素的提取工艺

󰀁73󰀁

StudyonExtractionTechnologyofHypocrellinAfrom

themyceliaofShiraiabambusicola

DUWen,SUNChun󰀁long,HANYan󰀁feng,LIANGJian󰀁dong,DONGXuan,

1245

LIANGZong󰀁qi,YUJian󰀁ping,GUOLi󰀁li,ZHANGHong󰀁tao

(1.InstituteofFungusResources,GuizhouUniversity,Guiyang550025,China;2.GuizhouKeyLaboratoryofAgriculturalBioengineering,KeyLaboratoryofGreenPesticideandAgriculturalBioengineering,MinistryofEducationGuizhouUniversity,Guiyang550025,China;3.CenterofBiochemicalEngineeringinGuizhouProvince,GuizhouUniversity,Guiyang550025,China;4.AgriculturalBureauofLanshanDistrictLingiCityShandongProvience,Linyi276000,China;5.QingdaoMunicipalHospita,lQingdao266011,China)

1,2

3

1﹡

1

1

Abstract:ExperimentsweredesignedtostudythetechnicalconditionofethanolextractionfrommyceliaofShira󰀁iabambusicola.TheoptimalprocesswasstudiedwithyieldandcontentofHypocrellinAbysinglefactortestsandorthogonaltesttoshowtheeffectsoftemperature,time,ratioofmaterials,organicsolvents,smashinglevelandextractdryingtemperature.Theexperimentalresultsshowthattheoptimumtechnologicalconditionswere,myceliaon3.0gwithdryingtemperature35󰀁,aftersmashingtheamountofethanoladdedwas40m,lthetotaltime24h,extractiontemperatureof30󰀁,extractiontime24h,thebestHypocrellinAextractionresultswasobtained.

Keywords:shiraiabambusicola;hypocrellinA;extractiontechnology

(上接第69页)

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ResearchontheApplicationofPetrographic

AnalysisinCoalBlendingforCoke󰀁making

CHENGuo󰀁qing,ZHUWei󰀁dong,WUXian󰀁xi

(CollegeofMaterialsandMetallurgy,GuizhouUniversity,Guiyang550003,China)

*

Abstract:Theanalysismethodofusingpetrographicanalysistoidentifycoalqualityanddistinguishthesituation

ofmixedcoalcokeproductionisveryimportantinblending.Thismethodhasmadeupsomeinsufficientaspectsofproximateanalysisincoalqualitytes.tInthepaper,basedonadditivepropertyofreflectanceforsinglekindofcoaltocombineintoreflectancedistributiondiagramofcoalblendtoguidecoalblendforcoke󰀁making,thiscanimprovethequalityofcoke.Keywords:petrographicanalysis;reflectanceofvitrinite;singlecoa;lmatchingcoal