食用菌学报＠２０１６．２３（３）：６１￣６６ ＤＯＩ：１０．１６４８８／ｊ．ｃｎｋｉ．１００５—９８７３．２０１６．０３．０１２ 蛹虫草固体发酵生产虫草素的条件优化 吐尔尼散・吐地 。，张忠 ，唐庆九 ，周 帅 ，刘艳芳¨ （ 上海市农业科学院食用菌研究所，农业部南方食用菌资源利用重点实验室，国家食用菌工程技术研究中心， 国家食用菌加工技术研发分中心，上海市农业遗传育种重点开放实验室，上海２０１４０３； 中国药科大学，江苏南京２１１１９８） 摘 要：用直径６ ｃｍ，高１０ ｃｍ聚乙烯培养罐固体发酵蛹虫草（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｍｉｌｉｔａｒｉｓ），以固体发酵产物中虫草 素含量为指标，从１６个蛹虫草菌株中筛选出虫草素含量最高的菌株，考察固体发酵该菌株的培养基组成、培 养时间、培养基装量、料液比、培养温度、接种量和添加物对虫草素含量的影响，得到了有利于蛹虫草固体发酵 产虫草素的培养条件：培养罐装２０ ｇ小麦，按小麦干重６％的量分别加入玉米粉和黄豆粉，按料液比１：１．４（ｗ： ｖ，以小麦干重为基准）加入营养液（ｇ／Ｌ：２．０ Ｋ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏ，０．５ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，１６甘氨酸），培养温度为 ２６℃，时间４６ ｄ，接种量１Ｏ％。 关键词：蛹虫草；虫草素；固体发酵 蛹虫草（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｍｉｌｉｔａｒｉｓ）又称北虫草、北冬虫夏草，是虫草属的模式菌，分类学上属于肉座菌 目（Ｈｙｐｏｃｒｅａｌｅｓ）、虫草菌科（Ｃｏｒｄｙｃｉｐｉｔａｃｅａｅ）、虫草属（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ）［ 。蛹虫草富含虫草素、腺苷、虫草 酸、虫草多糖和甾醇等多种化学成分，其中虫草素为蛹虫草的主要活性成分之一，具有抗肿瘤、抗衰老、 改善记忆力、抗菌抗炎、抗病毒、调节免疫力、降血糖、抗氧化等功效［２］。目前，人们主要从蛹虫草子实 体或菌丝体中提取纯化获得虫草素。蛹虫草子实体培养时间较长，受各种因素的影响，不同来源的子 实体中虫草素含量差别较大，文献报道的含量在０．０３％～０．２９％＿３］。虽然蛹虫草已实现规模化生产， 但用子实体作为虫草素的来源，价格十分昂贵，这很大程度上限制了虫草素在临床上的广泛使用。研 究发现，蛹虫草固体发酵产物中虫草素含量较子实体中高，其它核苷类成分很少，可作为分离纯化虫草 素的优良原料［３］。目前，小麦和大米是蛹虫草固体发酵的主要培养基 ，而小麦与稻米相比更易得， 价格低廉，且有报道称麦麸、钙、磷、钾及维生素Ｂ对虫草素的生物合成具有一定的促进作用 ］。因 此，笔者以小麦为主要基质，研究蛹虫草固态发酵产虫草素的条件，为提高虫草素的生产效率及固体发 酵生产虫草素的工业化提供参考。 １材料与方法 １．１菌株 蛹虫草（Ｃ．ｍｉｌｉｔａｒｉｓ）供试菌株１６个，分别编号为１．１６号（原始菌株号依次为：１８０８、１８１１、４６３１、 １８１０、４６３２、０１５２、４６３３、４６３４、１８１２、１８０９、４６３５、４６３６、４６３８、４６３９、４６４０、４６４１），其中３、５号菌株由昆明 食用菌研究所提供，１１号菌株由上海市农业科学院食用菌研究所高君辉副研究员惠赠，其余均由上海 市农业科学院食用菌研究所菌种保藏中心提供。 １．２虫草素含量测定 采用高效液相色谱法测定虫草素含量。Ｗａｔｅｒｓ ２６９５高效液相色谱仪，Ｂｒｅｅｚｅ工作站，２４８７紫外 检测器（美国Ｗａｔｅｒｓ公司）；色谱柱为ＡＱ－Ｃ１８柱（２５０ ｍｍ×４．６ ｍｍ，５ ｒＬｍ）；流动相为甲醇（Ａ）．水 收稿日期：２０１６—０３—０２原稿；２０１６—０４—２０修改稿 基金项目：农业部公益性行业专项（２０１３０３０８０）和闵行区科技项目（２０１４ｍｒ１１０６）资助 作者简介：吐尔尼散・吐地（１９８８一），女，在读硕士，主要从事食用菌生物发酵与有效成分的分离纯化方面研究。 本文通讯作者Ｅ－ｍａｉｌ：ａｌｉｕ．１９８０＠１６３．ｃｏｍ ６２ 食用菌学报 第２３卷 （Ｂ），梯度洗脱：０—５ ｍｉｎ，５％Ａ．９５％Ｂ；５—１５ ｍｉｎ，１５％Ａ ８５％Ｂ；１５—２０ ｍｉｎ，２５％Ａ．７５％Ｂ；２０— ２５ ｍｉｎ，２５％Ａ一７５％Ｂ；２５—２６ ｍｉｎ，５％Ａ一９５％Ｂ；２６—３５ ｍｉｎ，５％Ａ．９５％Ｂ；流速１ ｍＬ／ｍｉｎ，柱温 ３０℃，检测波长２５４ ｎｍ，进样量１０ Ｌ。以虫草素标准品的进样浓度为横坐标，色谱峰的面积为纵坐 标，绘制标准曲线。 １．３液体菌种制备 将母种接在ＰＤＡ斜面上，２６℃培养８ ｄ。取０．５ ｃｍ×０．５ ｃｍ的菌块接种到装１００ ｍＬ液体培养 基（ｇ／Ｌ：４０葡萄糖，１５鱼粉蛋白胨，０．５ ＫＨ２ＰＯ ，０．５ Ｋ ＨＰＯ ・３Ｈ Ｏ，０．５ ＭｇＳＯ ・７Ｈ。Ｏ，ｐＨ自然） 的２５０ ｍＬ三角瓶中，２６℃，１５０ ｒ／ｍｉｎ振荡培养８ ｄ得一级种。将一级种以１０％接种量接种到装 １００ ｍＬ液体培养基的２５０ ｍＬ三角瓶中，２６℃，１５０ ｒ／ｍｉｎ振荡培养６ ｄ，得到蛹虫草液体菌种。 １．４高产虫草素菌株的筛选 称取３０ ｇ小麦置于直径６ ｇｉｌｌ，高１０ ｃｍ的聚乙烯培养罐中（以下实验均采用该规格培养罐），按小 麦干重的６％加入黄豆粉和玉米粉，即玉米粉和黄豆粉各１．８ ｇ，按１：１的比例（Ｗ：ｖ，小麦干重为基准） 加入营养液（ｇ／Ｌ：２．０ Ｋ２ ＨＰＯ ・３Ｈ２ Ｏ，０．５ ＭｇＳＯ ・７Ｈ ｏ），聚丙烯透气膜封口，浸泡１６～２０ ｈ， １２１℃灭菌３５ ｍｉｎ，分别接人１６个菌株的液体种，接种量１０％（以小麦干重为基准，即３ ｍＬ），每个菌 株接６罐，２６℃黑暗培养６０ ｄ后收集发酵产物，６０℃烘干粉碎，测定其虫草素含量，选择虫草素含量最 高的菌株进行以下实验。 １．５培养时间和固体培养基组成的选择 按照不同配方制备固体培养基（表１），置于培养罐中，按１：１的比例（ｗ：ｖ，小麦干重为基准）加入营 养液（３０ ｍＬ），灭菌、接种等操作同１．４，培养４６ ｄ，配方Ａ做３０个平行罐，Ｂ、ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ配方各做３ 个平行罐。在培养第１０￣４６天期间，每４ ｄ取配方Ａ处理的培养罐３罐，收集发酵产物，其余配方处 理在培养结束后收集发酵产物，６０℃烘干，粉碎后测定虫草素含量。 表１固体培养基配方 ａｈｂｌｅ １ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ｇｒｏｗｔｈ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ｕｓｅｄ ｆｏｒ Ｃ ｍｉｌｉｔａｒｉｓ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ 配方中均有３０ ｇ小麦；“＋”代表配方中添加该物质，“一”代表配方中不添加该物质；玉米粉、豆饼粉、蚕蛹粉、奶粉、黄豆粉和蛋清的添加 量为小麦干重的６％，即１．８ ｇ；配方Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ中加入３０ ｍＬ营养液１（ｇ／Ｌ：２．０ ＫｚＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏ，０．５ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２ｏ），配方ｃ中 加入３０ ｍＬ营养液２（ｇ／Ｌ：２０葡萄糖，２．Ｏ ＫｚＨＰ０４・３Ｈ２Ｏ，０．５ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２ｏ） Ｉｎ ａｄｄｉｔｉｏｎ ｔｏ １．８ ｇ ｏｆ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ｃｏｒｎ ｐｏｗｄｅｒ，ｓｏｙｂｅａｎ ｍｅａｌ，ｓｉｌｋｗｏｒｍ ｐｕｐａ ｍｅａｌ，ｍｉｌｋ ｐｏｗｄｅｒ，ｓｏｙｂｅａｎ ｐｏｗｄｅｒ ｏｒ ｅｇｇ ｗｈｉｔｅｓ）， ｅａｃｈ ｆｏｒｍｕｌａ ａｌｓｏ ｃｏｎｔａｉｎｅｄ ３０ ｇ（ｄｒｙ ｗｔ）ｗｈｅａｔ；Ｔｈｉｒｔｙ ｍＬ ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ１（ｇ／Ｌ：２．０ Ｋ２ＨＰｏ４・３Ｈ２０，０．５ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２ｏ）ｗａｓ ａｄｄｅｄ ｔｏ ｆｏｒｍｕｌａｅ Ａ，Ｂ，Ｅ，Ｆ ａｎｄ Ｇ，ａｎｄ ３Ｏ ｍＬ ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ２（ｇ／Ｌ：２０ ｇｌｕｃｏｓｅ，２．０ Ｋ２ＨＰＯ４・３ＨｚＯ，０．５ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０） ｗａｓ ａｄｄｅｄ ｔｏ ｆｏｒｍｕｌａ Ｃ：”Ｂｙ．ｐｒｏｄｕｃｔ ａｆｔｅｒ ｏｉｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｓｏｙｂｅａｎｓ １．６培养基装量的选择 在培养罐中分别加入２０、３Ｏ、５０和７０ ｇ小麦，按上述实验结果选择虫草素产量高的１个配方添加 其余成分，各成分的添加量为小麦干重的６％，按１：１的比例（Ｗ：ｖ，以小麦干重为基准）加入营养液，每 个处理３个平行罐，按１．５的结果选择合适的培养时间，其余操作同１．４，测定不同培养基装量对虫草 素含量的影响，选择合适的培养基装量进行以下实验。 １．７料液比的选择 按上述实验结果在培养罐中加入适量培养基，按料液比１：１、１：１．２、１：１．４（Ｗ：Ｖ，以小麦干重为基 ６４ 食用０．６ 菌学报 第２３卷 含量最低；Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｇ的虫草素含量没 有显著差异，分别是０．４７％、０．４９％、 ０．４５％和０．５０％。选择Ｇ配方进行以 下实验。 ０．５ 蜘ｌ互０．４ 蓬．薯￡ ｎｚ Ｏ．１ ０．Ｏ ２．４培养基装量 由图４可知，固体培养基的装量会 影响虫草素的产生。１０ ｄ是蛹虫草菌 丝长满期，发酵４６ ｄ后，２０ ｇ装量组中 培养基的虫革素含量最高，为０．４５％， 与其它３组相比差异显著，因此选择 ２０ ｇ进行以下实验。 ２．５料液比 Ａ Ｂ Ｃ Ｄ Ｅ Ｆ Ｇ 培养基配方Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｓｕｂｓ￣ａｔｅ 不同小写字母表示在Ｐ＜０．０５水平差异显著 Ｖａｌｕｅｓ ａｒｅ ｔｈｅ ｍｅａｎｓ±ＳＤ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ：ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌｏｗｅｒ ｃａｓｅ ｌｅｔｔｅｒｓ ｉｎｄｉｃａｔｅ ａ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ａｔ Ｐ＜０．０５：ｏｔｈｅｒ ｆｏｏｔｎｏｔｅｓ ａｓ ｉｎ Ｔａｂｌｅ １ 图３不同培养基配方对菌株１４虫草素含量的影响 Ｆｉｇ．３ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｏｎ ｃｏｒｄｙｃｅｐｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｃ ｍｉｌｉｔａｒｉｓ ｓｔｒａｉｎ １４ 图５为料液比对虫草素的含量的影响。料液比１：１．４时虫草素含量最高，因此选择该料液比进 行以下实验。 Ｏ．５ 不同小写字母表示在Ｐ＜Ｏ．０５水平差异显著；Ｉ～Ⅳ：培养基 中分别加入２０、３Ｏ、５Ｏ、７Ｏ ｇ小麦，玉米粉、黄豆粉添加量为小 麦重量的６％。营养液添加量分别为２Ｏ、３Ｏ、５Ｏ、７０ ｍＬ（ｇ／Ｌ： ２．０ Ｋ２ＨＰ０４・３Ｈ２Ｏ，０．５ ＭｇＳ０４・７ＨｚＯ） Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｂｏｔｔｌｅｓ（ｄｉａｍｅｔｅｒ ６ ｃｍ，ｈｅｉｇｈｔ １０ ｃｍ） ｃｏｎｔａｉｎｅｄ：（Ｉ）２０ ｇ ｗｈｅａｔ，１．２ ｇ ｃｏｒｎ ｐｏｗｄｅｒ，１．２ ｇ ｓｏｙｂｅａｎ ０．４ ｛０—３ 彗’：ｌ ｏ‘ ０．１ Ｏ．０ 一 一崔 ｌｕ。 口一 。』（ 。ｒＪ删舡懈褂茸 ｐｏｗｄｅｒ，２０ ｍＬ ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｇ／Ｌ：２．０ ＫｚＨＰ０４・３ＨｚＯ， Ｏ．５ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）；（ＩＩ）３０ ｇ ｗｈｅａｔ，１．８ ｇ ｃｏｒｎ ｐｏｗｄｅｒ， １．８ ｇ ｓｏｙｂｅａｎ ｐｏｗｄｅｒ，３０ ｍＬ ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ；（ＩＩＩ）５Ｏ ｇ ｗｈｅａｔ，３．０ ｇ ｃｏｒｎ ｐｏｗｄｅｒ，３．０ ｇ ｓｏｙｂｅａｎ ｐｏｗｄｅｒ，５０ ｍＬ ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ；（ＩＶ）７Ｏ ｇ ｗｈｅａｔ，４．２ ｇ ｃｏｒｎ ｐｏｗｄｅｒ，４．２ ｇ Ｉ Ⅱ Ⅲ Ⅳ ｓｏｙｂｅａｎ ｐｏｗｄｅｒ，７０ ｍＬ ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ．Ｏｔｈｅｒ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ 培养基装量Ｔ０ｔａｌ ｗｅｉｇｈｔ ｏｆ ｍｅｄｉｕｍ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ａｓ ｉｎ Ｆｉｇ．２ 图４ 固体培养基装量对菌株１４虫草素含量的影响 Ｆｉｇ．４ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｗｅｉｇｈｔ ｉｎ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｖｅｓｓｅｌ ｏｎ ｃｏｒｄｙｃｅｐｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｃ．ｍｉｌｉｔａｒｉｓ ｓｔｒａｉｎ １４ ２．６培养温度 ０．５ 图６为培养温度对虫草素含量的影响。２６℃适 ０．４ 合于虫草素的产生，而温度太高或太低都不利于虫草 Ｏ．３ 素的产生。 ２．７接种量 Ｏ２ 图７表明各接种量处理间虫草素含量无显著性 差异，从经济角度考虑，接种量选择１０％。 ２．８培养基中添加前体化合物对虫草素产量的影响 图８的结果表明，在培养基中添加一定浓度的甘氨 Ｏ．１ ０．Ｏ １：ｌ １：１．２ １：１．４ 料液比％ｌｉｄ：ｌｉｑｕｉｄ ｒａｔｉｏ 酸和腺嘌呤可提高蛹虫草发酵物中的虫草素含量，和未 添加前体化合物的处理相比，在实验浓度范围内，当营 养液中甘氨酸添加浓度为８、１６和２０ ｇ／Ｌ时，发酵物中 不同小写字母表示在Ｐ＜Ｏ．０５水平差异显著 Ｖａｌｕｅｓ ａｒｅ ｔｈｅ ｍｅａｎｓ±ＳＤ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ；ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌｏｗｅｒ ｃａｓｅ １ｅｔｔｅｒｓ ｉｎｄｉｃａｔｅ ａ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ａｔ Ｐ＜ ０．０５；Ｓｏｌｉｄ（ｄｒｙ ｗｅｉｇｈｔ ｏｆ ｗｈｅａｔ）：ｌｉｑｕｉｄ（ｖｏｌｕｍｅ ｏｆ ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）ｒａｔｉｏ；Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｇｒｏｗｎ ｆｏｒ ４６ ｄ ｏｎ ｍｅｄｉｕｍ Ｇ（２０ ｇ ｗｈｅａｔ，１．２ ｇ ｃｏｒｎ ｐｏｗｄｅｒ，１．２ ｇ ｓｏｙ・ ｂｅａｎ ｐｏｗｄｅｒ） 虫草素含量都得到提高，其中１６ ｇ／Ｌ的处理虫草素 含量最高，与对照相比提高了１０７％，而营养液中腺嘌 呤的添加浓度为０．０５ ｇ／Ｌ时虫草素含量显著提高， 其它处理均不能显著提高虫草素含量。 图５料液比对菌株１４虫草素含量的影响 Ｆｉｇ．５ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｓｏｌｉｄ：ｌｉｑｕｉｄ ｒａｔｉｏ ｏｎ ｃｏｒｄｙｃｅｐｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｃ ｍｉｌｉｔａｒｉｓ ｓｔｒａｉｎ １４ 第３期 吐尔尼散・吐地，等：蛹虫草固体发酵生产虫草素的条件优化 ６５ 一 ｌｕ∞ｌｕ。。 Ｉｄ 。ｈｐＪｏｒ】咖扣憾抖茸 叭 一 岩尝。 ＝Ｉｄ ｐＩ。ｒ）删如懈料茸 １６ ２１ ２６ ３２ １０ ２０ ３Ｏ ４Ｏ ５Ｏ 培养温度Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（℃） 接种量Ｉｎｏｃｕｌｕｍ ｓｉｚｅ（％） 不同小写字母表示在Ｐ＜Ｏ．０５水平差异显著 不同小写字母表示在Ｐ＜Ｏ．０５水平差异显著 Ｖａｌｕｅｓ ａｒｅ ｔｈｅ ｍｅａｎｓ±ＳＤ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ：ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌｏｗｅｒ Ｖａｌｕｅｓ ａｒｅ ｔｈｅ ｍｅａｎｓ±ＳＤ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ；ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌｏｗｅｒ ｃａｓｅ ｌｅｔｔｅｒｓ ｉｎｄｉｃａｔｅ ａ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ａｔ Ｐ＜０．０５ ｃａｓｅ １ｅｔｔｅｒｓ ｉｎｄｉｃａｔｅ ａ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ａｔ Ｐ＜０．０５ Ｍｅｄｉｕｍ：２０ ｇ ｗｈｅａｔ，１．２ ｇ ｃｏｒｎ ｐｏｗｄｅｒ，１．２ ｇ ｓｏｙｂｅａｎ Ｍｅｄｉｕｍ：２０ ｇｗｈｅａｔ，１．２ ｇ ｃｏｒｎ ｐｏｗｄｅｒ，１．２ ｇ ｓｏｙｂｅａｎ ｐｏｗｄｅｒ， ｐｏｗｄｅｒ，２８ ｍＬ ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｇ／Ｌ：２．０ ＫｚＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏ， ２８ ｍＬ ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｇ／Ｌ）：２．０ Ｋ２ＨＰＯ４・３Ｈｚ Ｏ，０．５ ０．５ ＭｇＳＯ４・７Ｈｚｏ）；ｓｏｌｉｄ：ｌｉｑｕｉｄ ｒａｔｉｏ １：１．４ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０）；ｓｏｌｉｄ：ｌｉｑｕｉｄ ｒａｔｉｏ １：１．４；ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ２６℃ 图６ 培养温度对菌株１４虫草素含量的影响 图７接种量对菌株１４虫草素含量的影响 Ｆｉｇ．６ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｎ Ｆｉｇ．７ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｉｎｏｃｕｌｕｍ ｓｉｚｅ ｏｎ ｃｏｒｄｙｃｅｐｉｎ ｃｏｒｄｙｃｅｐｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｃ．ｍｉｌｉｔａｒｉｓ ｓｔｒａｉｎ １４ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｃ．ｍｉｌｉｔａｒｉｓ ｓｔｒａｉｎ １４ ０．７ Ｏ．６ 一 置尝。＿ｌｕ一争。ｈｐＪ。ｒ】 姐 擗茸 ¨ ∞ ０．叭 ∞ ５ ｏ．４ ●■●●■■ ０．３ ●■■Ｉｎ２ ０．１ ●■■●ＩｎＯ ０ ｌ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８ ９ １０ ｌｌ ｌ２ ｌ３ ｌ４ ｌ５ ●■●●■■ 添加物Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ 不同小写字母表示在Ｐ＜Ｏ．０５水平差异显著；营养液中添加的前体化合物及其浓度：０为对照，１～５分别为１、４、８、１６和２０ ｇ／Ｌ甘氨 酸，６～１０分别为０．０５、０．１、０．５、１和２ ｇ／Ｌ腺嘌呤，ｌ１～１５分别为Ｏ．１、０．２、０．２５、０．５和１ ｇ／Ｌ腺苷 ●■■■Ｉ Ｖａｌｕｅｓ ａｒｅ ｔｈｅ ｍｅａｎｓ±ＳＤ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ；ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌｏｗｅｒ ｃａｓｅ ｌｅｔｔｅｒｓ ｉｎｄｉｃａｔｅ ａ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ａｔ Ｐ＜Ｏ．０５ Ｍｅｄｉｕｍ：２０ ｇ ｗｈｅａｔ，１．２ ｇ ｃｏｒｎ ｐｏｗｄｅｒ，１．２ ｇ ｓｏｙｂｅａｎ ｐｏｗｄｅｒ，２８ ｍＬ ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ，ｓｏｌｉｄ：ｌｉｑｕｉｄ ｒａｔｉｏ １：１．４，ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ２６℃，ｉｎｏｃｕｌｕｍ ｓｉｚｅ １％．Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ：［Ｏ］，ｎｏｎｅ（ｃｏｎｔｒｏ１）；［１—５］，１，４，８，１６ ａｎｄ ２０ ｇ／Ｌ ｇｌｙｃｉｎｅ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ；［６－ １０］，０．０５，０．１，０．５，１ ａｎｄ ２ ｇ／Ｌ ａｄｅｎｉｎｅ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ；［－１１—１５］，０．１，０．２，０．２５，０．５ ａｎｄ １ ｇ／Ｌ ａｄｅｎｏｓｉｎｅ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ 图８前体化合物对菌株１４虫草素含量的影响 Ｆｉｇ．８ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ ｏｎ ｃｏｒｄｙｃｅｐｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｃ ｍｉｌｉｔａｒｉｓ ｓｔｒａｉｎ １４ ３讨论 虫草素是蛹虫草的次生代谢产物，虫草素的快速累积需要一定的时间、碳氮源、氧气和前体化合 物。本实验通过测定不同发酵时间内固体培养基中虫草素含量的结果发现，培养基中的虫草素含量在 前期一直处于较低的水平，随发酵时间增加，不断积累到一定值。培养罐中培养基装量对虫草素的含 量有显著影响，随着培养基装量增多，虫草素含量下降，可能因为培养基装量多的处理，培养罐中的空 气流通相对较少，不利于虫草素的产生。虫草素的前体化合物种类很多，本研究发现，合适浓度的甘氨 酸和腺嘌呤对虫草素的产生有促进作用。在实验过程中发现，随着菌株传代次数的增加，菌株活力下 降，导致虫草素产量的下降。在菌株发酵时间的确定试验中，虫草素含量最高值在４６ ｄ左右，而从培养 基装量实验开始，虫草素产量有所下降，这可能与菌株功能的退化有关，所以在实际生产过程中应减少 菌株的传代次数，保证菌株的最优状态。 ６６ 食用菌学报 第２３卷 参考文献 ［１］周思静，刘桂君，尚宏忠，等．蛹虫草人工培养技术研究进展ＥＪ］．江苏农业科学，２０１４，４２（７）：３－１７． ［２］黄冕，张松．虫草素生理功效的研究进展［Ｊ］．菌物研究，２０１０，８（４）：２３４．２３８，２４４． ［３］刘艳芳，唐庆九，杨焱，等．蛹虫草及其培养基中主要核苷类成分的分析比较［Ｊ］．食品科学，２０１０，３１（４）：１３９ １４２． Ｅ４］温鲁，夏敏，宋虎卫，等．固体培养蛹虫草核苷类次生代谢物的产率［Ｊ］．食品科学，２００５，２６（１１）：６５．６７． ［５］韦会平，叶小莉，张华英，等．用蛹虫草固体发酵高效生产虫草素的研究ＥＪ３．中国中药杂志，２００８，１９（１０）： ２１５９．２１６２． ［６］游明乐．发酵虫草菌质与天然虫草主要活性成分含量比较研究ＥＪ］．生物技术通报，２００９，２５（２）：１２９—１３１． ［７］刘洋，黄芳芳，王赢蕾，等．蛹虫草固态发酵生产虫草素工艺优化研究［Ｊ］．核农学报，２０１４，２８（４）：２０６５．２０７０． ｆ－ｓ］阮元，马进川，薛元，等．维生素Ｂ１、Ｂ６和生长激素２，４一Ｄ对蛹虫草液体发酵虫草素产量的影响［Ｊ］．菌物学报， ２０１４，３３（２）：４４７—４８２． ［９］康超，文庭池，康冀川，等．不同培养条件和前体对蛹虫草液体发酵产虫草素的影响［Ｊ］．菌物学报，２０１２，３１（３）： ３８９．３９７． ［１０］刘桂君，周思静，杨素玲，等．蛹虫草中虫草素的研究进展［Ｊ］．食品科学，２０１３，３４（２１）：４０８．４１３． ［１１］韦会平．虫草素的生物合成及化学结构修饰［Ｄ］．重庆：西南大学，２００９． Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ Ａｆｆｅｃｔｉｎｇ Ｃｏｒｄｙｃｅｐｉｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｍｉｌｉ ｔａｒｉｓ Ｄｕｒｉｎｇ Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｎ Ｓｏｌｉｄ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ＴＵＤＩ・Ｔｕｅｒｎｉｓａｎ １，２，ＺＨＡＮＧ Ｚｈｏｎｇ ，ＴＡＮＧ Ｑｉｎｇｊｉｕ ，ＺＨｏＵ Ｓｈｕａｉ ，ＬＩＵ Ｙａｎｆａｎｇ ［ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｅｄｉｂｌｅ Ｆｕｎｇｉ，Ｓｈａｎｇｈａｉ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｅｄｉｂｌｅ Ｆｕｎｇｉ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ ａｎｄ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ（Ｓｏｕｔｈ），Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｐ．Ｒ．Ｃｈｉｎａ；Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｅｄｉｂｌｅ Ｆｕｎｇｉ；Ｎａｔｉｏｎａｌ ＲＯＤ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｅｄｉｂｌｅ Ｆｕｎｇｉ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ；Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｏｆ Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｓｈａｎｇｈａｉ ２０１４０３，Ｃｈｉｎａ； Ｃｈｉｎａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｎａｎｊｉｎｇ，Ｊｉａｎｇｓｕ ２１１１９８，Ｃｈｉｎａ］ Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｍｉｌｉｔａｒｉｓ ｓｔｒａｉｎ １４ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ａｍｏｕｎｔｓ ｏｆ ｃｏｒｄｙｃｅｐｉｎ ａｍｏｎｇ １６ ｔｅｓｔ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｈｅｎ ｇｒｏｗｎ ａｔ ２６℃ｆｏｒ ６０ ｄ ｉｎ ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｂｏｔｔｌｅｓ（ｄｉａｍｅｔｅｒ ６ ｃｍ，ｈｅｉｇｈｔ １０ ｃｍ）ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ３０ ｇ ｗｈｅａｔ，１．８ ｇ ｃｏｒｎ ｐｏｗｄｅｒ，１．８ ｇ ｓｏｙｂｅａｎ ｐｏｗｄｅｒ ａｎｄ ３０ ｍＬ ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｇ／Ｌ：２．０ Ｋ２ＨＰＯ４。３Ｈ２Ｏ， ０．５ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２ ０）．Ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ（ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ，ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ，ｗｅｉｇｈｔ ｏｆ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｉｎ ｔｈｅ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｏｔｔｌｅ，ｓｏｌｉｄ—ｌｉｑｕｉｄ ｒａｔｉｏ，ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ａｎｄ ｉｎｏｃｕｌｕｍ ｓｉｚｅ）ａｆｆｅｃｔｉｎｇ ｅｏｒｄｙｃｅｐｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｉｓ ｓｔｒａｉｎ ｗｅｒｅ ｔｈｅｎ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｕｓｉｎｇ ｍｏｎｏｆａｃｔｏｒｉａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｈｉｇｈｅｓｔ ｃｏｒｄｙｃｅｐｉｎ ｌｅｖｅｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｗｅｒｅ ｒｅｃｏｒｄｅｄ ｗｈｅｎ ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｂｏｔｔｌｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ２０ ｇ ｗｈｅａｔ，１．８ ｇ ｃｏｒｎ ｐｏｗｄｅｒ．１．８ ｇ ｓｏｙｂｅａｎ ｐｏｗｄｅｒ，ａｎｄ １．４ ｖｏｌｕｍｅｓ ｏｆ ａ ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ（ｇ／Ｌ）２．０ Ｋ２ＨＰＯ４。３Ｈ２０， ０．５ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２ Ｏ ａｎｄ １６．０ ｇｌｙｃｉｎｅ，ｗｅｒｅ ｓｅｅｄｅｄ ｗｉｔｈ ａ １０％ｉｎｏｃｕｌｕｍ ｏｆ Ｃ．ｍｉｌｉｔａｒｉｓ ｓｔｒａｉｎ １４ ａｎｄ ｉｎｃｕｂａｔｅｄ ａｔ ２６℃ｆｏｒ ４６ ｄ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｍｉｌｉｔａｒｉｓ；ｃｏｒｄｙｃｅｐｉｎ；ｓｏｌｉｄ—ｓｔａｔｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ［本文编辑］ 朱丽娜