（1）0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)：
A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4·12H2O（分子量358.14）71.7g；B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取分别用蒸馏水定容到
1000ml。
A母液(Na2HPO4) 228.75ml，B母液(NaH2PO4) NaH2PO4·2H2O（分子量156.01）31.2g。
SOD）活性测定（氮蓝四唑光化还原法）
0.05mol/L PBS（pH7.8）的配制：分别取21.25ml，用蒸馏水定容至
1000ml。
参考文献：李合生主编：植物生理生化实验原理和技术
（2）14.5mM甲硫氨酸溶液：取
.高等教育出版社，2000：267～268。
2.1637g Met用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至1000ml。
100ml。
（3）30μM EDTA-Na2溶液：取0.001gEDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至（4）60μＭ核黄素溶液：取
0.0023g核黄素用磷酸缓冲液定容至
100ml，避光保存。
（5）2.25mM 氮蓝四唑(NBT)溶液：取0.1840g NBT用PBS定容至100ml，避光保存。酶液制备：取0.2g（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）
洗净后置于预冷的研钵中，
4℃、
加入1.6ml 50mmol/L预冷的磷酸缓冲液（pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在12000g下离心20min，上清液即为酶液。2、酶活性测定
（1）反应混合液配制(以60个样为准)：分别取Met溶液162ml，EDTA-Na2溶液0.6ml，磷酸缓冲液5.4ml，NBT溶液6ml，核黄素溶液
（2）分别取3ml反应混合液和（3）将试管置于光照培养箱中在同时做两支对照管，其中后测定作为最大光还原管，另
6ml,混合后摇匀；
30μl酶液于试管中
4000 lux光照下反应20min；
30μl PBS（不加酶液）照光
1支试管取3ml反应混合液加入
1支只加缓冲液置于暗中测定时用于调零。
调零后，避光测OD560(出现颜色即
（4）以不照光的对照管（只有缓冲液并置于暗处）可测定)。
（5）酶活性计算：SOD活性单位以抑制在最大管的一半左右才合适，否则要调整酶量
SOD总活性＝
NBT光化还原50％所需酶量（测的样品值要）为1个酶活单位（u）。
[( Ack-AE )×V]/（1/2Ack×W×Vt）
SOD比活力＝SOD总活性/蛋白质含量SOD总活性以鲜重酶单位每克表示（Ack为照光对照管的吸光度；
u/g FW）；比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示；
AE为样品管的吸光度；V为样品液总体积（ml,1.6ml，加入PBS
ml，30ul）；W为样品鲜重（g，测定时应换算为叶绿体
的体积)；Vt为测定时的酶液用量（的质量mg）；蛋白质含量单位为二、POD、CAT酶活性的测定
粗酶液制备同
SOD。
mg/g。
1、过氧化物酶（POD）活性测定（愈创木酚法）
（1）试剂配制：
0.2mol/L磷酸缓冲液(pH6.0)：分别取A母液(Na2HPO4 ) 123ml和B母液(NaH2PO4 ) 877ml混匀即为1000ml PBS(0.2M，pH6.0)；
（2）反应混合液配制（以
60个样为准）：
2-甲氧基酚）加热
取200ml PBS(0.2M，pH6.0)，加入0.076ml液体（原液）愈创木酚（搅拌溶解，冷却后加入
（3）样品测定：取3ml反应液并加入
0.112ml 30％的H2O2，混匀后保存于冰箱中备用。
30μｌ酶液，以PBS为对照调零，而后测定OD470值（测定40秒）。
5秒，动作要快，如果慢的话，
要保证每个样品从加好样到开
（边加样边测定，测定前等待始记时的时间相差不大
）
（4）酶活性计算：以每min OD值变化（升高）0.01为1个酶活性单位（u）。
(u/g min)
POD=（ΔA470×Vt）/（W×Vs×0.01×t）ΔA470：为反应时间内吸光度的变化；
W为样品鲜重(g)；t为反应时间(min)；Vt为提
ml，30ul）。
取酶液总体积（ml，(1.6ml）；Vs为测定时取用酶液体积（2、过氧化氢酶（CAT）活性测定
（1）试剂配制：
0.15mol/L磷酸缓冲液（pH7.0）：取A母液(Na2HPO4) 457.5 ml 和B母液(NaH2PO4) 292.5 ml混合后用蒸馏水定容至
（2）反应液配制：取摇匀即可。
（3）样品测定：取
3ml反应液加入0.1ml（可视情况调整）酶液，以
PBS为对照调零，
1000ml。
200ml PBS（0.15M，pH7.0），加入0.3092ml 30%的H2O2（原液）
测定OD240（紫外）（测定40s）。
（4）酶活性计算：以每
min OD值减少0.01为1个酶活性单位（u）。
(u/g min)
W为样品鲜重(g)；t为反应时间(min)；Vt为提
ml, 0.1ml）。
CAT=[ΔA240×Vt ]/（W×Vs×0.01×t）ΔA240：为反应时间内吸光度的变化；
取酶液总体积（ml，1.6ml）；Vs为测定时取用酶液体积（四、超氧阴离子自由基（1、试剂的配制
（1）1mM盐酸羟胺溶液：称取
O2.-）产生速率的测定（羟胺氧化法）
0.02085g盐酸羟胺用蒸馏水定容至300ml；
（2）17mM对氨基苯磺酸溶液：称取醋酸：水=1：3配制）加热溶解后定容至
（3）7mMα-萘胺溶液：称取定容至400ml。
.-2、O2含量的测定
1.1776g对氨基苯磺酸用少量冰醋酸水溶液（冰400ml；
=3：1配制）
0.4008gα-萘胺用冰醋酸水溶液（冰醋酸：水
（1）样品液提取方法同SOD测定；
中加入0.5ml PBS（0.05M，pH7.8），
（2）取0.5ml提取液（酶液）（可视情况调整用量）1ml 1mM盐酸羟胺溶液后摇匀。
（3）在25℃下保温1小时；
（4）依次先加入1ml 17mM对氨基苯磺酸，再加入1ml 7mM α-萘胺，混合后快速摇匀；（5）在25℃下保温20min后在3000×g下离心3min后马上进行测定（或置于冰箱待测）；（6）以对照管调零（用水调零）（7）O2.-含量的计算：由测得的的反应式：NH2OH＋2O2.-＋H+
，取粉红色水相液测定
OD530值（测定）；
O2
.-
OD530，查NO2-标准曲线得到[NO2-]；根据羟胺与
-.--.-
NO2＋H2O2＋H2O 计算[O2]，即[NO2]×2=[O2]；再
根据样品与羟胺反应的时间和样品中的蛋白质含量，求得蛋白表示，也可以
nmol min-1g-1鲜重表示）。
O2.-产生速率（以
nmol min-1mg-1
.-W）O2产生速率=（C×V）/（t×（nmol min-1g-1鲜重）
(叶绿体稀释后的体
C为标准曲线上查得的浓度(umol/L)；V为测定时所取提取液用量
g)
积)；t为反应时间(60min)；W为样品鲜重(叶绿体实际质量参考文献：王爱国，罗广华．植物生理学通讯，五、丙二醛含量的测定1、试剂配制：
10%TCA：100g 三氯乙酸
→ 1L
1990，（6）：55～57
0.67%TBA：3.35g硫代巴比妥酸2、测定步骤:
→ 500ml 10%TCA （避光）
0.2 样品+1.6ml 10%TCA 研磨→12000g 离心 10min →上清1.5ml +1.5 0.67% TBA 煮30min →冷却，离心→上清3、计算组织中
MDA含量：
450，OD532，OD600OD
→沸水
MDA浓度C (umol/L)=6.45(OD532-OD600)-0.56OD450 MDA含量(umol/g FW)=C×V/W
式中V为提取液体积(1.6ml)，W为样品鲜重(0.2g)。六、植物细胞质膜透性的测定（电导仪法）（1）取新鲜叶片或根系（不能萎蔫）遍后用吸水纸吸干水分；
（2）样品剪碎（也可打孔取样）放入试管（或室温下放置3h使叶片充分吸水后测定溶液电导率（3）再放入恒温水浴锅中在后测定溶液电导率
(R2)；
：
100℃沸水浴中煮
15ml大离心管）中，加(R1)；
20min以杀死叶片组织，用冷水冷却到室温
10ml去离子水，在
0.3g，用自来水冲洗表面污渍，再用去离子水冲洗几
（4）用公式计算质膜相对透性（用相对电导率表示）
相对电导率（%）=R1/R2×100%
还可以计算植株伤害程度：
伤害率=（处理电导率—对照电导率）
七、可溶性蛋白含量的测定（考马斯亮蓝染色法）1、试剂的配制
（1）考马斯亮蓝溶液配制：称取
100 mg考马斯亮蓝，溶于
50 ml 90％乙醇中，加入
/（煮沸电导率—对照电导率）×
100%
100 ml 85％（W/V）的磷酸，再用蒸馏水定容到1Ｌ。在过夜后过滤并贮于棕色瓶中，常温
下可在暗中保存一个月。
（2）100μg/ml牛血清蛋白（BSA）标准溶液：称取25mg BSA加水溶解后定容至再从中吸取40ml用蒸馏水定容至标准BSA溶液）。
2、样品可溶性蛋白含量的测定
（1）样品可溶性蛋白含量测定：取酸缓冲液（即稀释成
20μｌ提取液（酶液）加入
80μｌ，0.05M，pH7.8磷
2min后测OD595
100 ml，
100 ml（也可取10mg BSA定容至100ml即为100μg/ml
0.1ml提取液），再加入2.9ml考马斯亮蓝溶液，反应
（以100μｌ缓冲液加2.9ml考马斯亮蓝为对照调零）。
（2）蛋白质含量计算：可溶性蛋白质含量（
mg/g）=(C×VT)/(W×VS×1000)
μｇ）；VT为提取液总体积（稀释后的体积
ml）；VS
C为标准曲线查得的蛋白质含量（为测定时所用提取液体积（
ml，20μｌ）；W为样品鲜重（g）。
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