ｒｅｃｅｉｖｅｄ ａｎ ｅａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ ｆｒｏｍ ＭＣ ｔｏ ＣＣ ｏｒ ｇｏｔ ａ ｌｏｎｇｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ’＿ｆｒｅｅ ｔｉｍｅ． Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ ＳＴＲ—ＰＣＲ ｐｒｏｖｉｄｅ ａ ｓｉｍｐｌｅ，ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ ｅｃｏｎｏｍｉｃ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｏｆ ｃｈｉｍｅｒｉｓｍ ａｆｔｅｒ ｔｒａｎｓ。 ｐｌａｎｔａｔｉｏｎ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ ｓｈｏｒｔ ｔａｎｄｅｍ ｒｅｐｅａｔｓ Ｎｏｎ——ｍｙｅｌｏａｂｌａｔｉｖｅ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ Ｎｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｃｈｉｍｅｒｉｓｍ 非清髓异基因造血干细胞移植（ＮＡＳＴ）由于减 量的放、化疗预处理加上强效的免疫抑制，移植后多 形成供、受体细胞不同比例的混合嵌合体，并呈动态 变化¨＇ 。嵌合体监测对分析植入状态，判断疾病 复发及指导移植后续治疗具有重要意义。短串联重 复序列（ＳＴＲ）是目前检测嵌合体最常用的遗传标 记，我们采用ＳＴＲ—ＰＣＲ半定量方法对２８例接受 ＮＡＳＴ的患者进行了嵌合体的检测，现报告如下。 １资料与方法 １．１病例资料 观察对象为２００３年至２００５年在东南大学附属 中大医院血液科接受ＮＡＳＴ的患者２８例，男１９例， 女９例，年龄１５岁～５８岁，中位年龄３７岁。其中 慢性粒细胞白血病（ＣＭＬ）１９例，慢性淋巴细胞白血 病（ＣＬＬ）１例，急性非淋巴细胞白血病（ＡＭＬ）３例， 骨髓增生异常综合征（ＭＤＳ）４例，非何杰金氏淋巴 瘤（ＮＨＬ）１例。同胞供者２４例，无血缘关系供者２ 例，ＨＬＡ配型均为全相合；单倍型亲缘供者２例，均 为ＤＲ位点不合。供、受者性别相合１８例，性别不 合１０例。ＡＢＯ血型相合２１例，血型不合７例。 １．２方法 １．２．１标本收集和处理 术前采集供者和受者外周血２ ｍｌ，术后＋７天、 ＋１４天、＋２１天、＋３０天采集患者外周血，此后据 患者随访时间采集外周血每月１次或每３月１次。 行供体淋巴细胞输注（ｄｏｎｏｒ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｉｎｆｕｓｉｏｎ， ＤＬＩ）治疗后每１５天采集受者外周血１次，直至可评 价的终点。移植后早期造血抑制期每次抽血５ ｍｌ， 此后每次２ ｍｌ，ＡＣＤ抗凝，于采血后２４ ｈ内用红细 胞裂解液裂解红细胞，提取白细胞，用Ｃｈｅｌｅｘ一１００ 法快速提取基因组ＤＮＡ，编号后置一２０℃冰箱保 存。 １．２．２ ＳＴＲ基因座的选择 本研究选择ＳＴＲ位点的原则是：均为四碱基重 复序列（错配较少）；杂合度较高（有较高的个体识 别能力）；等位基因个数适中，平均６～１０个（易于 分型）；等位基因频率在研究人群所属地区分布较 好。按文献 ’ 选择Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ３Ｓ１３５８、 Ｄ８Ｓ１１７９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１６ｓ５３９、ＦＧＡ、ｖｗＡ ８个位点进 行检测。 １．２．３嵌合体检测 先对供、受者术前标本在上述８个位点进行扩 增，对扩增产物行非连续非变性聚丙烯酰胺凝胶电 泳和硝酸银染色显影，根据等位基因阶梯（Ｌａｄｄｅｒ） 对照阅读各位点的基因型，找出各组供、受体可区 分彼此的有信息位点，按Ｔｈｉｅｄｅ等 报告的方法进 行分类，选择出Ｉ类和Ⅱ类位点，术后标本仅在Ｉ类 和Ⅱ类位点扩增，凝胶用ＵＶＰ成像分析系统进行灰 度扫描后用Ｇｅｌ—Ｐｒｏ ４．０软件分析，选择相应的公 式以整合光密度（ＩＯＤ）值计算供体细胞嵌合率 （ＤＣ）。 １．２．４嵌合体的界定 完全嵌合体（ＣＣ）：ＤＣ＞９５％；混合嵌合体 （ＭＣ）：５％＜ＤＣ＜９５％；高比例嵌合体（ＨＭＣ）：ＤＣ ＞５０％；低比例嵌合体（ＬＭＣ）：ＩＤＣ≤５０％。 ２结果 移植１个月后，２８例患者中仅１例ＭＤＳ—ＲＡ 患者未检测到嵌合体，造血始终未恢复，ＡＮＣ＜０．１ ×１０ ／Ｌ，骨髓增生极度减低，证明移植失败，于移 植后４５天死于严重感染。余２７例患者均形成不同 比例的供、受者造血细胞嵌合体，其中２２例形成 ＣＣ；５例形成ＭＣ；２例形成高比例混合嵌合 （ＨＭＣ）；３例低比例混合嵌合（ＬＭＣ）。所有稳定植 入的患者在＋７天时的平均嵌合率是７４．７１％，此时 尚处于造血抑制期，＋１４天多数病例达ＣＣ，平均嵌 合率是９５．７４％。移植后随访１．５月～２７月，平均１１ 个月，２２例ＣＣ患者中３例患者复发前检测到ＤＣ 下降，１例在ＣＣ状态下复发，长期存活者均保持稳 定ＣＣ。５例ＭＣ患者中，１例ＬＭＣ的ＣＬＬ患者早期 出现移植排斥，＋１月时ＳＴＲ—ＰＣＲ检查仅在ｖｗＡ、 Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ５Ｓ８１８位点检测到少量的供者型遗传标 记（ＤＣ为２７％），但血常规检查提示造血恢复，考虑 为早期移植排斥，自身造血恢复，经２次ＤＬＩ后逐渐 达到ＣＣ，并保持稳定ＣＣ（见图１）；另２例ＬＭＣ患 者早期复发，１例死亡，１例经二次标准移植后获得 ＣＣ。２例ＨＭＣ患者中的１例为ＣＭＬ，移植后１月即 ５５ 维普资讯 http://www.cqvip.com 为ＭＣ（ＤＣ为５４％），及时予ＤＬＩ １次，ＤＬＩ后＋１．５ 型（见图２）。另１例ＨＭＣ患者＋１月后进行性下 月时已有治疗反应，ＤＣ上升到８０％，出院后患者未 降，脾肿大，骨髓增生明显活跃，诊断为脾功能亢进， ＳＴＲ—ＰＣＲ检查持续ＭＣ，ＤＬＩ后未见ＤＣ上升，＋４ 月时行脾切除治疗，＋８月时转为ＣＣ，并保持稳定 ＣＣ。 能继续监测嵌合体，＋４月时出现遗传学复发（Ｐｈ 阳性染色体占９０％），再次入院，予ＤＬＩ １次，疗效 不佳，迅速出现血液学复发，嵌合体检测为完全受者 ４ ５ ６ 图１ １例ＣＬＬ患者移植排斥予ＤＬＩ治疗后由ＭＣ过渡为ＣＣ的电泳图 ［１：受者移植前；２：＋３０ｄ为ＬＭＣ，予ＤＬＩ治疗；３：＋４５ｄ予第二次ＤＬＩ； ４：ＤＬＩ后３月接近ＣＣ；５：供者；６：等位基因阶梯（Ｌａｄｄｅｒ）］ ｌ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８ ９ ｌ０ 誓 ？ 曩 羹 图２ １例ＭＣ的ＣＭＬ复发患者行ＤＬＩ治疗后不同时间段的电泳图 ［１：受者移植前；２：＋３０ｄ为ＭＣ予ＤＬＩ治疗；３，４：ＤＬＩ后３０ｄ、４５ｄ ＤＣ上升； ５：＋４月遗传学复发，次ＤＬＩ治疗；６～８：ＤＬＩ后１５ｄ、３０ｄ、４５ｄ为完全受者型， 临床血液学复发；９：供者；１０：等位基因阶梯（Ｌａｄｄｅｒ）］ ３讨论 程序检测嵌合体，虽然具有自动化程度高、无交叉污 染、省时快速等优点，但由于多个位点在同一反应管 ＳＴＲ是一类呈高度多态性的遗传标记，ＳＴＲ— ＰＣＲ技术灵敏、快速，是目前最常用的检测嵌合体 的方法之一 。国内外有多家移植单位采用荧光 标记的多重ＰＣＲ结合ＤＮＡ测序仪和基因扫描软件 ５６ 内扩增，其敏感性阈值较单一位点ＳＴＲ—ＰＣＲ方法 的敏感性低，并且对仪器设备要求高，长期监测费用 昂贵，国内难以普及。我们采用ＳＴＲ—ＰＣＲ结合聚 维普资讯 http://www.cqvip.com
丙烯酰胺凝胶电泳和银染色以及凝胶成像分析技术 检测嵌合体的方法，首先筛选出能区别供、受体的有 信息的位点，并进一步找出敏感性较高的分析位点， 在移植后嵌合体的长期监测中，我们只需选择对供 受者适合的少数位点进行检测即可反映足够的临床 信息，并且不需特殊的试剂仪器，简便易行。同时我 们还发现，微卫星位点的选择十分重要，并非所有的 信息位点都适合于嵌合体的定量检测，有些位点在 定性分析时有意义，但在定量分析时意义有限。嵌 合体检测的目的主要是在以供者细胞为前提的条件 下发现受者细胞，影响定量分析结果的一个重要因 素是等位基因的长度。由于ＰＣＲ时存在以下两种 现象影响扩增效率的一致性：（１）短片段优先扩增； （２）平台效应。因此，在选择分析位点时，应满足受 者等位基因长度小于供者等位基因长度。同时我们 进一步发现，如果目的基因是纯合子，则检测的敏感 性更高。但在实际应用中，如果患者和供者的血缘 关系非常近，有可能找不到符合上述条件的ＳＴＲ位 点，就不得不选择一些敏感性较次的位点。 我们的研究发现植入成功的患者在＋１４天多 数达ＣＣ，在之后的随访中，凡长期存活的病例都能 保持稳定ＣＣ，５例ＭＣ均不稳定，有ＤＣ进一步下降 导致移植排斥和复发的倾向。此结果提示早期供体 植入率是影响ＮＡＳＴ能否发生移植排斥的重要因 素，＋１００天内更应加强嵌合体监测并及时采取预 防措施。ＳＴＲ—ＰＣＲ技术可在严重粒细胞缺乏阶段 实施，嵌合体检测虽然不能直接检测出残留的白血 病细胞，但由于受体细胞比例增加与移植排斥和复 发的危险性高度相关 ｊ，因此可通过定量检测供 体细胞嵌合率，来判断患者体内残留的受体细胞水 平。ＤＬＩ是移植后临床干预治疗的重要组成部分， 其诱导的移植物抗白血病效应（ｇｒａｆｔ ｖｅｒｓｕｓ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｅｆｆｅｃｔ，ＧＶＬ）在肿瘤细胞负荷低时易发挥根治性作 用，把握ＤＬＩ的时机和数量是取得较好疗效的关键。 ＳＴＲ—ＰＣＲ通过定量检测ＤＣ的消长趋势，可以确定 实施ＤＬＩ的时机和强度，判断ＤＬＩ的疗效，尤其适用 于无特异性肿瘤标志基因异常的恶性血液病患 者 。 因此，我们认为，在移植后嵌合体的长期监测 中，ＳＴＲ—ＰＣＲ结合聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染色 以及凝胶成像分析半定量检测嵌合体的方法是一种 简单、敏感、经济的监测方法。 参考文献 ［１］Ｌｅ Ｂｌａｎｃ Ｋ，Ｒｅｍｂｅｒｇｅｒ Ｍ，Ｕｚｕｎｅｌ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ａ ｃｏｍ— ｐａｒｉｓｉｏｎ ｏｆ ｎｏｎｍｙｅｌｏａｂｌａｔｉｖｅ ａｎｄ ｒｅｄｕｃｅｄ—ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ ｆｏｒ ｌａｌｏｇｅｎｅｉｃ ｓｔｅｍ—ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ， ２００４，７８（７）：１０１４—１０２０ ［２］Ｍｉｃｈａｆｆｅｔ ＡＳ，Ｆｕｍｔ Ｓ，Ｌｅ ＱＨ．ｅｔ ａ１．Ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｃｈｉｍ— ｅｒｉｓｍ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｎ ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｏｕｔｃｏｍｅ ａｆｔｅｒ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ａｎｄ ｒｅｄｕｃｅｄ——ｉｎ－－ ｔｅｎｓｉｔｙ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ ｒｅｇｉｍｅｎｓ［Ｊ］．Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ，２００５，１２８ （５）：６７６—６８９ ［３］杜志淳，李莉，林源，等．“中国罪犯ＤＮＡ数据库” 模式库——１３个ＳＴＲ位点基因在中国人群中的分布［Ｊ］． 法医学杂志，２０００，１６（１）：１—５ ［４］俞卫东，闵涯邻，张斌，等．江苏地区汉族人群１５ 个ＳＴＲ基因座遗传频率调查［Ｊ］．中国法医学杂志，２００３， １８（４）：２４５—２４６ ［５］Ｔｈｉｅｄｅ Ｃ，Ｆｌｏｒｅｋ Ｍ，Ｂｏｍｈａ Ｍ，ｅｔ １ａ．Ｒａｐｉｄ ｑｕａｎｔｉ— ｉｆｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｘｅｄ ｃｈｉｍｅｒｉｓｍ ｕｓｉｎｇ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ａｍｐｌｉｉｆｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｈｏｒｔ ｔａｎｄｅｍ ｒｅｐｅａｔ ｍａｒｋｅｒｓ ａｎｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，１９９９，（２３）：１０５５—１０６０ ［６］Ｎｏｌｌｅｔ Ｆ，Ｂｉｌｌｅｔ Ｊ，Ｓｅｌｌｅｓｌａｇ Ｄ，ｅｔ ａ１．Ｓｔａｎｄａｒｄｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｓｈｏｒｔ ｔａｎｄｅｍ ｒｅｐｅａｔ ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ ｃｈｉｍｅｒ— ｉｓｍ ｔｅｓｔｉｎｇ［Ｊ］．Ｂｏｎｅ Ｍａ￣ｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，２００１，２８：５１１—５１８ ［７］Ｅｌｍａａｇａｃｌｉ ＡＨ．Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｏｆｒ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｍｉｎｉ— ｍａｌ ｒｅｓｉｄｕａｌ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ｃｈｉｍｅｒｉｓｍ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ａｆｔｅｒ ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ｉｎｔ Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ，２００２，７６（Ｓｕｐｐｌ ２）：２０４—２０５ ［８］Ｃｈａｌａｎｄｏｎ Ｙ，Ｖｉｓｃｈｅｒ Ｓ，Ｈｅｌｇ Ｃ，ｅｔ １ａ．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｈｉｍｅｒｉｓｍ ａｆｔｅｒ ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｂｙ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｉｆｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｍａｒｋｅｒｓ ａｎｄ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｅｌｅｃｔｒｏ— ｐｈｏｒｅｓｉｓ ｗｉｔｈ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ：ｔｈｅ Ｇｅｎｅｖａ ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ ［Ｊ］．Ｌｅｕｋｅｍｉａ，２００３，１７：２２８—２３１ ［９］万理萍，王椿，彦式可，等．异基因造血干细胞移 植后的嵌合状态分析［Ｊ］．中华内科杂志，２００６，４５（６）： ４８５—４８８ ［１０］Ｂａｄｅｒ Ｐ，Ｋｒｅｙｅｎｂｅｒｇ Ｈ，Ｈｏｅｌｌｅ Ｗ，ｅｔ ａ１．Ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｍｉｘｅｄ ｅｈｉｍｅｒｉｓｍ ｉｓ ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｆａｃｔｏｒ ｆｏｒ ｕｎｆａｒｏｒａｂｌｅ ｏｕｔｃｏｍｅ ｉｎ ｃｈｉｌｄｒｅｎ ｗｉｔｈ ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ ａｆｔｅｒ ａｌｌｏ— ｇｅｎｅｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ：ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ｐｒｅ—ｅｍｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ［Ｊ］．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ，２００４，２２：１６９６—１７０５ 收稿２００７—１１—１６ ５７
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