如何进行菌落原位杂交筛选分散菌落?

发布网友 发布时间：2024-10-24 00:46

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热心网友 时间：2024-11-13 19:29

原位杂交技术在筛选分散菌落时有着广泛应用。以下是具体操作步骤的概述：

首先，将筛选的100-200个菌落转移至工作流程中：（1）在含有抗生素琼脂平板上，放置一张纤维素滤膜，为菌落提供转移平台。（2）使用无菌工具，先将菌落从抗生素琼脂平板转移到滤膜上，再转移到无滤膜的主平板，采用划线接种的方式，确保每个菌落分别位于滤膜和主平板的对应位置。在主平板上还需划线含有非重组质粒的菌落作为对照。（3）培养至细菌菌落达到0.5-1.0mm宽后，用黑色绘图墨水在滤膜和主平板上做标记，主平板需封存于4℃待结果。（4）接下来，通过穿刺滤膜并标记位置，标记主平板上的对应位置。

接着进行菌落裂解及DNA结合过程：（1）在保鲜膜制作的小洼中，用0.5mol/L NaOH处理菌落，滤膜均匀湿润后，吸干并重复处理。（2）然后转移至不同浓度的Tris·Cl溶液中吸干，最后在滤纸上干燥，并用真空烤箱固定DNA。（3）固定后的DNA与32 P标记的RNA进行杂交。

杂交步骤如下：（1）将滤膜置于2×SSC液中预浸湿，然后转移到预洗液中，置于旋转平台上进行30分钟处理。（2）去除细菌碎片，然后转至预杂交液中，根据特定温度进行预杂交。（3）将探针加热后迅速冷却，加入杂交液中，确保密封以防止蒸发，过夜杂交。（4）杂交结束后，用2×SSC和0.1% SDS溶液洗涤滤膜，以去除未结合的DNA，必要时可进行更严格的洗涤。（5）最后，用放射自显影液处理滤膜，晾干后标记，再与X光片曝光，通过对比标记点鉴定阳性菌落。

这个过程展示了菌落原位杂交的详细步骤，从转移菌落到杂交结果的确认，每一步都严谨细致，确保了筛选结果的准确性。
扩展资料

原位杂交是指将特定标记的已知顺序核酸为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交，从而对特定核酸顺序进行精确定量定位的过程。原位杂交可以在细胞标本或组织标本上进行。另有荧光原位杂交。